田 靜 ,王 靖 ,冀 光 ,李 明

(中國石油大學(xué)(北京）化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102249）

鼠李糖脂生物表面活性劑及其純化方法研究進(jìn)展

田 靜 ,王 靖 ,冀 光 ,李 明

(中國石油大學(xué)(北京）化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102249）

鼠李糖脂生物表面活性劑是由微生物在一定的培養(yǎng)條件下分泌的次級代謝產(chǎn)物,具有良好的環(huán)境相容性,生產(chǎn)成本是制約其工業(yè)化應(yīng)用的主要因素。綜述了鼠李糖脂的常用純化方法,并對其研究方向進(jìn)行了展望。

鼠李糖脂;生物表面活性劑;純化;展望

生物表面活性劑是天然表面活性劑的一種,是微生物在特定條件培養(yǎng)時(shí)分泌的具有表面活性的一類代謝產(chǎn)物[1～3]。其中研究較多的是鼠李糖脂生物表面活性劑。與化學(xué)表面活性劑相比,鼠李糖脂生物表面活性劑除了具有類似的分子結(jié)構(gòu)、一定的表/界面活性外,還表現(xiàn)出良好的環(huán)境和生物兼容性,即具有無毒、無害、易降解的特性。因此,近年來廣泛用于環(huán)境治理、石油開采、生物醫(yī)藥、造紙及化妝品等領(lǐng)域[4～8],并逐步拓展其它領(lǐng)域的研究應(yīng)用。

由于化學(xué)表面活性劑合成步驟復(fù)雜、生產(chǎn)成本固定,而鼠李糖脂生物表面活性劑可以通過選擇經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分離方法、優(yōu)化操作工序來降低成本。因此,尋找經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、高效的分離純化生物表面活性劑的方法已經(jīng)成為科研工作者急需解決的問題。

作者在此綜述了鼠李糖脂常用的純化方法,擬為相關(guān)研究提供理論及技術(shù)基礎(chǔ)。

1 鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)

鼠李糖脂主要有4種結(jié)構(gòu)[9,10],如圖1所示。

圖1 銅綠假單胞菌合成的4種鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of four rhamnolipids produced by P.aeruginosa

2 鼠李糖脂的生物合成途徑

鼠李糖脂公認(rèn)的生物合成途徑由Burger等[11]和Ochsner等[12]通過放射性同位素標(biāo)記前體物質(zhì)的方法研究并提出(圖2）。在此合成途徑中,鼠李糖脂的合成是由一系列連續(xù)的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)完成的,每個(gè)反應(yīng)過程均由特定的鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行催化,其中腺苷二磷酸鼠李糖(d TDP2L-鼠李糖）作為糖基的供體,L-鼠李糖苷-β-羥基癸酰-β-羥基癸酸和β-羥基癸酰-β-羥基癸酸分別作為糖基的受體。

圖2 鼠李糖脂的生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic route of rhamnolipids

3 鼠李糖脂的純化方法

3.1 預(yù)處理微生物發(fā)酵液

微生物產(chǎn)鼠李糖脂,一般分泌在細(xì)胞外,易貼附于細(xì)胞壁上,因此,在分離純化之前,要進(jìn)行預(yù)處理,通過離心等操作將菌體細(xì)胞與培養(yǎng)液分開。

3.2 鼠李糖脂的分離純化

根據(jù)分離方法的不同,鼠李糖脂的分離純化分為初級純化和隨程提取。

3.2.1 初級純化

(1）沉淀法:微生物發(fā)酵液預(yù)處理之后,加入酸使生物表面活性劑沉淀[13],同時(shí)進(jìn)一步去除培養(yǎng)液中殘留的菌體細(xì)胞。具體方法是:向處理后的發(fā)酵液中加入酸類物質(zhì),使其最終p H值達(dá)到2～ 3;在4℃下放置,觀察是否有白色沉淀產(chǎn)生(生物表面活性劑不同,產(chǎn)生沉淀的時(shí)間也有所不同）,若有白色沉淀產(chǎn)生則產(chǎn)物是脂肽類表面活性劑,若沒有白色沉淀產(chǎn)生則是水溶性表面活性劑,離心收集沉淀。為了除去沉淀中夾帶的酸性物質(zhì),可以選擇合適的緩沖溶液重懸沉淀物[14]。

一般來說,在萃取前酸化發(fā)酵液沉淀產(chǎn)物可以提高萃取量。

(2）有機(jī)溶劑萃取法:有機(jī)溶劑萃取法是初步分離純化技術(shù),常用于去除水溶性雜質(zhì)。其原理是:利用物質(zhì)在互不相溶的兩相中分配系數(shù)的差異而使物質(zhì)達(dá)到分離的目的。戊烷、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇以及氯仿/甲醇等有機(jī)溶劑常被用于生物表面活性劑的分離純化[15～17]。王靖等[18]采用酸沉淀和有機(jī)溶劑萃取的方法篩選出的銅綠假單胞菌株Lz221,能以原油為碳源產(chǎn)鼠李糖脂表面活性劑。具體操作是:將發(fā)酵液離心去除菌體,用6 mol·L-1的鹽酸調(diào)上清液p H值為2.0,用等體積的乙酸乙酯萃取2次,合并有機(jī)相,40℃減壓蒸餾,得到黃色油狀的鼠李糖脂粗產(chǎn)品。

分離較低親水、親油平衡性的非離子型糖脂類表面活性劑時(shí),一般采用極性較低的甲基叔丁基醚(M TBE）作為萃取劑,這是因?yàn)镸 TBE具有不易燃、低毒性、可生物降解等優(yōu)點(diǎn),適用于生物表面活性劑的工業(yè)萃取。

3.2.2 隨程提取

(1）吸附法:根據(jù)疏水程度,通常采用聚苯乙烯樹脂或苯酚甲醛離子交換樹脂等同時(shí)具有吸附和解吸作用的疏水性的兩性物質(zhì)進(jìn)行吸附?；静襟E[19]是:將微生物發(fā)酵液離心后的上清液直接倒入裝有吸附劑的吸附柱中,用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)p H值至6.1(吸附劑的消耗可以通過測量表面張力得到）;用蒸餾水洗滌吸附劑去除可溶性物質(zhì)及游離脂肪酸;用有機(jī)溶劑將生物表面活性劑洗脫下來,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到生物表面活性劑粗品;將粗品溶解在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中,用色譜法進(jìn)一步純化生物表面活性劑。使用過的吸附劑用1 mol·L-1的NaOH溶液再生循環(huán)使用。

吸附過程通常在40℃、p H值5～10的條件下進(jìn)行,而脫附或解吸過程通常在30℃才能盡可能多地回收生物表面活性劑?；钚蕴肯鄬τ谄渌絼┰谏鲜鰲l件下能表現(xiàn)出良好的吸附性能,而且使用壽命長,能從生物表面活性劑中脫除絕大多數(shù)水溶性物質(zhì),是目前廣泛使用的吸附劑。

相對于萃取法,吸附法除了可以用于連續(xù)提取外,還能減少有機(jī)溶劑用量,節(jié)約成本。

(2）膜濾法:膜濾法是利用膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對物質(zhì)進(jìn)行選擇性分離的處理技術(shù)。當(dāng)液體混合物在一定壓力下流經(jīng)膜表面時(shí),小分子溶質(zhì)透過膜(稱為濾液）,而大分子物質(zhì)被截留,使原液中大分子濃度逐漸增大(稱為濃縮液）,從而實(shí)現(xiàn)大、小分子的分離,達(dá)到濃縮和凈化的目的。

近年來,膜濾法已經(jīng)成為提取純化生物表面活性劑的主要方法。根據(jù)生物表面活性劑結(jié)構(gòu)大小的不同,選用不同型號的薄膜。低p H值條件下,生物表面活性劑濃度在臨界膠束濃度(CMC）以上時(shí),蛋白質(zhì)和發(fā)酵液中的其它物質(zhì)更促進(jìn)了生物表面活性劑聚集成膠束[20],以致無法通過薄膜;但加入有機(jī)溶劑后,膠束會自行分散,生物表面活性劑隨溶劑透過薄膜。運(yùn)用此原理分別對原發(fā)酵液、初級濾液和甲醇處理過的次級濾液進(jìn)行高效液相色譜分析[21]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),如果有峰在原發(fā)酵液中出現(xiàn)、在初級濾液中消失、在次級濾液中重新出現(xiàn),則該峰為表面活性劑特征吸收峰;生物大分子在甲醇的作用下不會裂解,只會失活,因此只會在原發(fā)酵液中出現(xiàn),不會在初級和次級濾液中出現(xiàn),不會造成干擾。

膜濾法對產(chǎn)品損失很小,但是過濾層的積累會加大滲透壓力,造成溶劑流動的附加壓力,從而影響溶劑通過膜層的流動,對操作不利。因此,過濾時(shí),應(yīng)在膜表面處進(jìn)行混合攪拌,抑制過濾層的形成。

(3）泡沫分離法:泡沫分離法是連續(xù)提取的新方法,與膜濾法類似,利用了生物表面活性劑在臨界膠束濃度以上形成膠束的特性。微生物的好氧發(fā)酵過程中,在充氧和快速攪拌的作用下產(chǎn)生泡沫,生物表面活性劑膠束在其中穩(wěn)定存在。目的產(chǎn)物在泡沫上的吸附取決于p H值、離子強(qiáng)度和其它表面活性物質(zhì)的濃度等[22,23]。隨著在分離柱中停留時(shí)間的延長,重力作用使泡沫中水相液體下沉,有利于目的產(chǎn)物的回收。因此,可以從生物反應(yīng)器中分離出泡沫,通過酸處理或離心處理使膠束分散,獲得生物表面活性劑粗品。

3.3 不同純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

針對不同的生物表面活性劑,根據(jù)其性質(zhì)的差異,應(yīng)該選擇合適的分離純化方法。不同分離純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1。

表1 不同純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較Tab11 Comparison of different purification methods

4 展望

鼠李糖脂生物表面活性劑相對于化學(xué)表面活性劑具有環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn),因此在微生物采油領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景,如菌株Lz-21所產(chǎn)鼠李糖脂的臨界膠束濃度為0.63 g·L-1,接種24 h后其發(fā)酵液的表面張力達(dá)到最低值28 m N·m-1,對原油的乳化指數(shù)達(dá)78.6%,培養(yǎng)7 d后鼠李糖脂的濃度約為1.8 g·L-1。因此,菌株Lz-21能夠有效降解原油,提高原油采收率,同時(shí)也可以用于修復(fù)烴類污染。由于精細(xì)化工領(lǐng)域?qū)Ρ砻婊钚詣┚纫筝^高,導(dǎo)致生物表面活性劑的生產(chǎn)成本比化學(xué)表面活性劑要高出許多,所以生產(chǎn)成本是制約生物表面活性劑廣泛應(yīng)用的主要因素。要降低生產(chǎn)成本,一方面可以采用細(xì)胞融合技術(shù)等遺傳工程手段將多種降解基因轉(zhuǎn)入到同一微生物中構(gòu)建基因工程菌,提高菌株產(chǎn)表面活性劑能力;另一方面,可以優(yōu)化表面活性劑的分離純化操作。在節(jié)約成本的前提下,宜綜合運(yùn)用多種方法,同時(shí)結(jié)合先進(jìn)的技術(shù)手段(如色譜、光譜技術(shù)等）,開發(fā)出更多更好的分離純化方法。

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Research Progress of Rhamnolipid Biosurfactant and Its Purification Methods

TIAN Jing,WANG Jing,JIGuang,LIMing
(Faculty of Chemical Science&Engineering,China University of Petroleum,Beijing 102249,China）

Rhamnolipid biosurfactant is the secondary metabolites secreted by microorganism s under certain culture conditions.It has a good environmental compatibility,but the cost of production is the major limiting factor in its industrial applications.The review is outlined in terms of the methods in purification of rhamnolip- id.The development trend of this field in the future is forecasted.

rhamnolipid;biosurfactant;purification;p rospect

TQ 423

A

1672-5425(2010）06-0013-04

國家科技部863課題子課題基金資助項(xiàng)目(2009AA 063504）,中石油天然氣股份有限公司科技管理部科技開發(fā)基金資助項(xiàng)目(2008A21403）

2010-03-09

田靜(1987-）,女,黑龍江人,碩士研究生,研究方向:應(yīng)用微生物學(xué)、微生物采油;通訊作者:王靖,博士,教授。E-mail:tianjing1-001@163.com,sw hgw j898@cup.edu.cn。