周曉明,莫雋穎,陶 冶,付水林,宮 衡

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237）

黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)

周曉明,莫雋穎,陶 冶,付水林,宮 衡

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237）

根據(jù) GenBank報(bào)道的黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,分別以黑曲霉 H7總 RNA及基因組DNA為模板,擴(kuò)增出β2葡萄糖苷酶基因bg l全長(zhǎng)及活性中心所在的外顯子5序列E5,分別將其連接到pMD182T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α測(cè)序。結(jié)果表明,bg l序列全長(zhǎng)2583 bp,與β2葡萄糖苷酶基因（XM 001398779.1）核苷酸序列同源性為99%,氨基酸序列同源性為99%,E5與bg l外顯子5區(qū)域同源性為100%。進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p ET32a（+）2bg l、p ET32a（+）2E5、p ET28a（+）2E5,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá),并進(jìn)行 SDS2PAGE電泳分析。

黑曲霉;β2葡萄糖苷酶;序列分析;蛋白表達(dá)

β2葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）屬于糖苷水解酶家族3,是纖維素酶系的重要組成部分,但其含量最低,不足1%,且活性普遍偏低,是纖維素酶解轉(zhuǎn)化的瓶頸[1]。因此許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者正致力于β2葡萄糖苷酶分子生物學(xué)方面的研究,以期改善纖維素酶的催化效率,實(shí)現(xiàn)纖維素資源的高效生物轉(zhuǎn)化。研究表明,黑曲霉是β2葡萄糖苷酶酶活較高的菌株[2,3],但關(guān)于黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因的研究報(bào)道仍然較少[4～7]。作者在此分別以黑曲霉（A.niger）H7總RNA及基因組DNA為模板,擴(kuò)增β2葡萄糖苷酶基因bg l全長(zhǎng)以及活性中心所在的外顯子5序列E5,并分別將兩段序列構(gòu)建到表達(dá)載體p ET32a（+）及p ET28a（+）上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),為研究黑曲霉β2葡萄糖苷酶的重組表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與質(zhì)粒

A.nigerH 7,自行篩選;E.coliDH 5α、E.coliBL 21（DE3）、p ET32a（+）、p ET28a（+）,自行保存 ;克隆載體pMD182T,大連寶生物公司。

1.2 工具酶及主要試劑

總RNA提取試劑、焦碳酸二乙酯（DEPC）、DNA MarkerⅢ、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒,北京天根公司;ExTaq DNA聚合酶、X2Gal、IPTG、PrimeScrip t RT Reagent試劑盒,大連寶生物公司;T4連接酶、BamH I、N otI限制性?xún)?nèi)切酶,Fer2 mentas公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1（將馬鈴薯切成1 cm3方塊,置于1000 mL水中煮沸,過(guò)濾收集液體,即得）,葡萄糖20 g·L-1,瓊脂粉 15 g·L-1。

1.4 黑曲霉總 RNA及基因組DNA的抽提

黑曲霉總RNA抽提采用 Trizol法,起始菌體量為500 mg,具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。抽提結(jié)束后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD230、OD260、OD280,并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

黑曲霉基因組DNA抽提采用CTAB法,具體步驟參照文獻(xiàn)[8]。

1.5 引物設(shè)計(jì)

以 GenBank上已經(jīng)發(fā)表的黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因序列bgl 1（登錄號(hào)為AJ132386）為模板設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,擴(kuò)增bg l全長(zhǎng)的上游引物為 bgl2F：5′2 CGGGA TCC A TGAGGTTCACTTTGA TCGAGGC2 3′,下游引 物為 bgl2R：5′2A TTTGCGGCCGC AGT2 GAACA GTAGGCA GAGACGCC23′,采用的限制性酶切位點(diǎn)（劃線部分）分別為上游BamHI和下游NotI。擴(kuò)增外顯子 5的上游引物為 E52F：5′2CGG2 GA TCCTCCGACTACAACTCTGCTTTCCCT23′,下游 引 物 為 E52R：5′2A TTTGCGGCCGCTGGCG2 GTCTTAGCAAGCGCCTCAA T23′。引物由上海生工公司合成。

1.6 目的片段的擴(kuò)增

cDNA第一條鏈的合成：冰上取總 RNA 5μL、Oligo d T 0.5μL、Random Primer 1μL、RNase2free H2O 3.5μL于65℃保溫10 min,加入5×RT Buffer 4μL、RNase2free H2O 5μL、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μL,于42℃保溫1 h后85℃滅活5 min。將20μL體系用dd H2O稀釋至50μL,于-20℃保存。

PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)（50μL體系）：10×ExTaq Buffer 5.0μL,dN TP 4.0μL,上游引物 1.0μL,下游引物1.0μL,cDNA第一條鏈 10.0μL,TaKaRaExTaq HS Enzyme 0.5μL,ddH2O 28.5μL補(bǔ)足。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 3 min,35個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。E5片段擴(kuò)增方法同上,采用基因組DNA為模板,退火溫度為59℃,延伸90 s。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收。

1.7 TA克隆

將上述純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Ta KaRa pMD182 T載體連接,10μL連接體系如下：1μL pMD182T載體,4μL目的片段、5μL Solution I,16℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用含有 X2Gal、IPTG和100μg·m L-1Amp的LB平板篩選陽(yáng)性克隆,對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒并進(jìn)行PCR或雙酶切驗(yàn)證。對(duì)鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果登陸NCB I網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.8 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述測(cè)序正確的質(zhì)粒用BamH I和N otI雙酶切后,與同樣雙酶切的表達(dá)載體連接,采用 T4 DNA連接酶,連接體系為：表達(dá)載體3.0μL,目的片段9.0 μL,5×Ligase Buffer 4.0μL,T4 DNA Ligase 1.0 μL,ddH2O 3.0μL補(bǔ)足至20.0μL。22℃連接6 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并用含有100μg·m L-1Amp的LB平板進(jìn)行篩選。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行雙酶切鑒定,將鑒定正確的陽(yáng)性克隆分別命名為p ET32a（+）2bg l、p ET32a（+）2E5、p ET28a（+）2E5,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL 21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。

1.9 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

從新鮮的LB平板上挑取重組菌菌落,接種于25 m L帶有相應(yīng)抗性的 LB培養(yǎng)基中,37℃、200 r·min-1過(guò)夜培養(yǎng),以1%的比例接種到30 m L抗性LB培養(yǎng)基,37℃、200 r·m in-1培養(yǎng)至OD600約為0.4～0.5時(shí),加入終濃度為1 mmol·L-1的 IPTG,30℃誘導(dǎo)表達(dá)約4 h。取1 m L菌液,12 000 r·min-1離心2 min,收集菌體,用 PBS緩沖溶液（p H值7.0）洗滌沉淀1～2次,并最終將其溶于500μL相同緩沖溶液中。超聲破碎細(xì)胞：功率200 W,每超聲2 s間隔4 s,共60次。4℃、12 000 r·min-1離心30 min,分別取上清與沉淀溶于相同的緩沖溶液中,以誘導(dǎo)前的重組菌株為對(duì)照進(jìn)行SDS2PAGE電泳,分析重組蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉總 RNA及基因組DNA的提取（圖1）

圖1 黑曲霉總 RNA（a）和黑曲霉基因組DNA（b）Fig.1 Total RNA（a）and Genome DNA（b）of Aspergillus niger H7

由圖1可以看出,抽提的黑曲霉總 RNA經(jīng)電泳后28 S和18 S條帶清晰,無(wú)拖尾,5 S部分降解較少,說(shuō)明RNA完整性好,且28 S亮度比18 S略高,雖不能完全達(dá)到2∶1的比例,但仍可作為模板進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè),RNA樣品的OD260/OD280均值為 1.942、OD260/OD230均值為2.061,說(shuō)明抽提的總RNA完整性較好,純度高,雖然有少量被降解的跡象,仍然能夠滿足后續(xù)RT2PCR的要求。

2.2 目的片段的擴(kuò)增（圖2）

圖2 RT2PCR擴(kuò)增 bg l（a）和PCR擴(kuò)增 E5（b）Fig.2 RT2PCRamplification of bgl（a）and PCR product of E5（b）

由圖2可以看出,擴(kuò)增出的bg l片段大小約為2600 bp,E5片段大小約為1200 bp,分別與理論值2583 bp及1192 bp相符,初步認(rèn)定是目的基因。

2.3 重組克隆載體的鑒定（圖3）

圖3 pMD182T2bgl的 PCR驗(yàn)證（a）和pMD182T2E5的雙酶切驗(yàn)證（b）Fig.3 Identification of pMD182T2bgl by PCR（a）and pMD182T2E5 by double digestion（b）

由圖3可以看出,經(jīng) PCR擴(kuò)增后,pMD182T2bgl能夠得到與目的片段大小相符的特異性條帶,pMD182T2E5雙酶切后產(chǎn)生的兩個(gè)條帶分別與載體及目的片段大小相對(duì)應(yīng),表明bgl與E5已經(jīng)成功克隆至 T載體。

2.4 bgl基因的序列測(cè)定及分析

對(duì)鑒定正確的重組菌株進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示bg l片段大小為2583 bp,其中 A 543個(gè)、T 579個(gè)、C 705個(gè)、G 756個(gè)、G+C為 56.56%。登錄 NCB I進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果顯示目的基因與4個(gè)分別來(lái)源于Aspergillus nigerNRRL3135（登錄號(hào) FN430671.1）、A s3.350（DQ 655704.1）、zju22（FJ262991.1）,CBS513.88（XM 001398779.1）菌株及一個(gè)Aspergil2lus niger未知菌株（EU 233788.1）的β2葡萄糖苷酶m RNA序列同源性高達(dá)99%,氨基酸序列同源性為99%。與CBS513.88相比,bg l核苷酸序列共有18處堿基不同,其中12處對(duì)應(yīng)的氨基酸序列未發(fā)生改變。

Bause等[9]提出糖苷水解酶家族3中成熟肽的第261位氨基酸A sp（D261）作為該酶的催化親核位點(diǎn)是高度保守的,并且其周?chē)被酼M SDW也是高度保守序列。以DNA為模板擴(kuò)增的E5序列正是包含該活性位點(diǎn)的區(qū)域,測(cè)序結(jié)果表明其氨基酸序列特征與上述報(bào)道完全一致,將其與全長(zhǎng)測(cè)序結(jié)果比對(duì),外顯子5區(qū)域同源性達(dá)100%。

第三個(gè)研究問(wèn)題旨在探索把英語(yǔ)作為二語(yǔ)或外語(yǔ)學(xué)習(xí)的大學(xué)生的詞匯量與語(yǔ)言能力之間的相關(guān)性。相關(guān)性分析結(jié)果表明，除中高級(jí)水平受試者的控制產(chǎn)出性詞匯知識(shí)量與其語(yǔ)言能力存在相關(guān)性以外，其它各變量間并無(wú)顯著相關(guān)性。對(duì)此有兩種可能的解釋?zhuān)阂环N可能性是測(cè)量工具本身，可能還沒(méi)有在不同的層次之間進(jìn)行足夠的區(qū)分。另一種可能是因?yàn)閷W(xué)生的詞匯量非常接近。因此，這一結(jié)論排除了將詞匯量測(cè)試作為獨(dú)立評(píng)估工具，來(lái)作為我們這樣的教學(xué)背景下語(yǔ)言能力水平指標(biāo)的可能性。然而，詞匯量測(cè)試的結(jié)果也可用于教學(xué)目的。通過(guò)調(diào)查學(xué)生的二語(yǔ)或外語(yǔ)詞匯知識(shí)，將為學(xué)生提供一個(gè)更合適的教學(xué)計(jì)劃，以提高他們的詞匯能力。

在 PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//www.expasy.o rg/p rosite）搜索目的蛋白功能結(jié)構(gòu)位點(diǎn),結(jié)果表明其成熟肽（去除1～19信號(hào)肽序列）247～264位序列為L(zhǎng)L KAELGFQGFVM SDWAA,其中第 261位為 A sp（D）,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,進(jìn)一步表明該酶是糖苷水解酶家族3成員。在線采用 PROTPARAM程序（ht2 tp：//expasy.org/cgi2bin/p rotparam）預(yù)測(cè)其編碼蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果表明其可編碼860個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),目的蛋白大小預(yù)計(jì)為93.3 kD,理論p I值為4.60,酸性氨基酸殘基總數(shù)（A sp+Glu）為100,堿性氨基酸（A rg+Lys）為60,表明其為酸性蛋白質(zhì)。20種氨基酸中甘氨酸（Gly）含量最高,為10.5%;丙氨酸（A la）次之,為9.7%。

2.5 重組表達(dá)載體的酶切鑒定（圖4）

圖 4 pET32a（+）2bgl（a）和 pET32a（+）2E5、pET28a（+）2E5（b）的雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Identification of pET32a（+）2bgl（a）and pET32a（+）2E5,pET28a（+）2E5（b）by double digestion

由圖4可以看出,經(jīng)BamH I及N otI雙酶切后,三個(gè)重組質(zhì)粒均能獲得兩個(gè)特異性條帶,大小分別與目的片段及載體相符,表明目的基因已成功構(gòu)建到表達(dá)載體。

2.6 重組蛋白的表達(dá)

經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件,最終獲得目的蛋白最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為：20℃下用0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12 h。SDS2PAGE電泳結(jié)果顯示,含有p ET32a（+）2bg l、p ET32a（+）2E5、p ET28a（+）2E5 的重組菌能夠產(chǎn)生特異性條帶,形成分子量約為114 kD、63 kD及48.9 kD的目的蛋白,與理論值93.3 kD和43.6 kD有差異,這是由于p ET32a（+）、p ET28a（+）質(zhì)粒本身分別帶有 Trx和/或 His標(biāo)簽序列,其編碼的蛋白與目的蛋白融合表達(dá)的結(jié)果。而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌并沒(méi)有目的蛋白的表達(dá)。經(jīng) Gel2p ro軟件分析,BGL目的蛋白含量約占總蛋白的32.14%。

經(jīng)超聲破碎之后,BGL蛋白大部分以包涵體形式存在于沉淀中,上清中只有少量蛋白表達(dá),見(jiàn)圖5。

M.Molecular massmarker 1,4,7,10.p ET28a（+）2E5誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后全菌體、上清、沉淀 2,5,8,11.p ET32a（+）2E5誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后全菌體、上清、沉淀 3,6,9,12.p ET32a（+）2bg l誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后全菌體、上清、沉淀

3 結(jié)論

（2）測(cè)序結(jié)果表明,bg l全長(zhǎng)2583 bp,推測(cè)其可編碼一個(gè)860個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),與β2葡萄糖苷酶基因（XM 001398779.1）核苷酸序列同源性為99%,氨基酸序列同源性為99%,屬于糖苷水解酶家族3,DNA上E5序列與bg l外顯子5部分同源性達(dá)100%。

（3）將重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),能夠成功獲得與預(yù)期大小相一致的融合蛋白。經(jīng)超聲破碎后,BGL蛋白大多以包涵體形式存在,上清中僅有少量蛋白,E5蛋白則完全以包涵體形式存在于沉淀中。

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Clon ing and Expression of Aspergillus N igerβ2Glucosidase Gene in Escherichia Coli

ZHOU Xiao2m ing,MO Jun2ying,TAO Ye,FU Shui2lin,GONG Heng（State Key L ab of B ioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai200237,China）

Acco rding to the sequence ofAspergillus nigerβ2glucosidase gene published in GenBank,two pairs of specific p rimers were designed and synthesized.Using the total RNA and genome DNA ofAspergillus nigerH7 as template,bg lgene and exon 5 sequence were amp lified.PCR p roduct were then cloned into pMD182T vector and sequenced,the results showed the nucleoside sequence ofbg lwas2583 bp,the homology of target gene and its deduced am ino acid sequence to the published could reach 99%and 99%,respectively.E5 sequence w as 100%identical to the exon 5 region ofbg l.Then the exp ression vecto rs p ET32a（+）2bg l,p ET32a（+）2E5,p ET28a（+）2E5 w ere constructed and transfo rmed intoEscherichia coliBL 21（DE3）.The recom bi2 nant strains w ere induced by 1 mmo l·L-1IPTG and the target p roteins w ere analyzed by SDS2PA GE.

Aspergillus niger;β2glucosidase;sequence analysis;p rotein exp ression

Q 786

A

1672-5425（2010）06-0050-04

2010-04-12

周曉明（1985-）,女,江蘇連云港人,碩士研究生,研究方向：分子生物學(xué);通訊作者：宮衡,教授。E2mail：gongheng@ec2 ust.edu.cn。