鄭 毅 王 婭 陳建平 張 藝

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響應面法優(yōu)化脂肪酶非水相催化合成生物柴油﹡

鄭 毅﹡﹡王 婭 陳建平 張 藝

福建師范大學生命科學學院

利用固定化脂肪酶非水相催化油酸與甲醇合成生物柴油。在前期研究的基礎上，采用響應面法優(yōu)化影響催化體系的3個重要因素：酶添加量、有機溶劑量、底物摩爾比，獲得最佳催化體系：在每g油酸加入0.568g的固定化脂肪酶及3.3mL的正己烷，油酸與甲醇摩爾比為1∶1.2。對響應面分析結果進行驗證試驗，結果表明轉化率達到95.56%，與響應面預測值95.99%的吻合程度較高。

脂肪酶 響應面法 生物柴油

生物柴油是生物質能的一種形式，其主要成分是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。它是通過生物油脂中脂肪酸與短鏈醇（甲醇或乙醇）在一定的條件下反應得到的脂肪酸酯類物質。生物柴油作為生物燃料，是一種可再生能源，受到全球科學家的廣泛關注。目前，工業(yè)上生物柴油的生產(chǎn)方法主要是化學合成法。由于該法以強酸或強堿為催化劑，反應過程產(chǎn)生大量的污染物，對環(huán)境的負面影響極大。利用脂肪酶進行生物柴油的催化合成，能較理想地避免化學合成法中產(chǎn)生的一系列負面效應，真正意義上實現(xiàn)了無污染、可再生的目的，打造了名副其實的“生物柴油”這一環(huán)保定義[1,2]。本研究利用固定化脂肪酶催化油酸與甲醇合成生物柴油（油酸甲酯），采用響應面法對工藝條件進行優(yōu)化，旨在以最優(yōu)的反應體系實現(xiàn)最大限度的提高轉化效率，為脂肪酶催化合成生物柴油提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 固定化脂肪酶：采用硅藻土吸附法制得。

1.1.2 化學試劑：橄欖油（CP，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司），聚乙烯醇PVA（聚合度1750±50），油酸（AR，汕頭市西隴化工廠有限公司），甲醇（AR，天津市永大化學試劑開發(fā)中心），95%乙醇、正己烷均為AR。

1.1.3 主要儀器：恒溫搖床（Beijing North TZ-Biotech Develop.Co.，SHK-99-Ⅱ）、電熱恒溫水浴鍋(國華企業(yè)，THZ-82)、高速組織搗碎機(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司，JJ-2)。

1.2 方法

1.2.1固定化脂肪酶酶活的測定

固定化脂肪酶酶活測定采用橄欖油水解法[3]。一個脂肪酶國際單位（IU）定義為：在pH7.2，38℃的條件下，每1min催化水解橄欖油產(chǎn)生1μmol游離脂肪酸的酶量。對于固定化酶粉以每g酶含有的脂肪酶國際單位數(shù)（U/g）表示[4]。

1.2.2非水相脂肪酶催化合成油酸甲酯的反應體系

在100mL具塞三角瓶中加入一定量的油酸、甲醇及有機溶劑構成的非水相反應體系，加入一定量的固定化脂肪酶，混合均勻，將反應瓶放入恒溫搖床中，在一定的溫度條件下，以150r/min的速度旋轉振蕩，并間隔一定的時間加入一定量的3A分子篩以吸收反應過程中產(chǎn)生的水。

1.2.3油酸甲酯轉化率的測定[5]

在恒溫搖床中反應一定時間后，取0.5mL樣液，加入5mL、95%乙醇終止反應，以1%酚酞為指示劑，用標準氫氧化鈉溶液滴定，并按下式計算油酸的轉化率：

式中：a為油酸甲酯的轉化率；V0為反應初始時樣品耗堿體積（mL）；V為反應一定時間后樣品耗堿體積（mL）。

2 結果與分析

2.1 試驗設計與結果

通過單因素輪換篩選試驗，初步確定影響脂肪酶催化合成生物柴油反應轉化率的主要因素有：反應體系中酶添加量、有機溶劑量、底物摩爾比。為了最快、最有效地找到它們的最佳組合，采用響應面法進行優(yōu)化，實現(xiàn)催化反應的最高轉化率。

通過分析，確定采用三因素三水平中心組合旋轉設計，以每g油酸所加酶量(X1)、底物物質的量之比(油酸與甲醇的物質的量之比，X2)、正己烷用量(X3)3個因素為研究對象，考察它們對反應過程中轉化率的影響，并對各個因素條件進行了優(yōu)化。該設計共15個試驗，對應的因素和水平見表1，實驗設計及結果見表2。結果表明：轉化率實測值與擬合值之間的差異非常小，較為吻合，平均擬合誤差只有0.23%，實際試驗結果得出的轉化率較為理想。

表1 響應面設計三因素和三水平取值

表2 Box-Behnken設計矩陣和響應數(shù)據(jù)的實測值與擬合值

2.2 建立二次響應面回歸模型

利用SAS統(tǒng)計軟件的二次響應面回歸（RSREG）進行數(shù)據(jù)分析，參數(shù)值見表3，得到擬合二次回歸方程如下：

表3 參數(shù)估計表

擬合二次回歸方程建立的模型可信度分析見表4。結果表明：（1）二次響應面回歸模型是極顯著（決定系數(shù)R2=0.97）,模型擬合程度較理想，說明這3個因素及其二次項能解釋Y變化的97%。（2）由表4可知，線性項P值為0.005、平方項P值為0.0187，說明因素線性及平方項變化對轉化率影響較大，而交互項P值為0.2358，反映出因素之間交互不明顯。（3）總模型回歸P值為0.0027，回歸極顯著，擬合不足P值為0.66，失擬程度極不顯著，因此該模型的擬合程度較高，可用于該催化反應體系優(yōu)化的理論推測。

2.3 回歸方程嶺脊分析尋找最佳組合

在獲得響應面分析結果以后，為了求得催化反應體系最佳組合，對響應參數(shù)進行嶺脊分析，得到最大酯化效率的最佳反應體系組合（如表5）：X1=0.71 (每g油酸加入0.568g固體酶)；X2=—0.06 (油醇摩爾比1∶1.2)；X3=—0.70 (2g油酸加入3.3mL正己烷 )，預測值為95.99%，即酯化效率最高時的最佳反應體系組成：每g油酸加入0.568g的固定化脂肪酶及3.3mL的正己烷；油酸與甲醇物質的量之比為1∶1.2。

2.4 回歸模型的驗證

以嶺脊分析得出的最佳反應體系組合進行催化反應試驗。分別以分析結果得出的最佳體系組合進行驗證試驗，預測值與實驗結果如表6所示，通過定時測定（如圖1）可知,最終轉化率達到95.59%，試驗值與預測值相差+0.417%，可見該分析方法可以較好地預測實際的轉化率情況，說明利用響應面分析法進行實驗優(yōu)化是可行有效的。

表4 模型方程方差分析表

表5 嶺脊分析估計最大響應變量Y

表6 回歸模型驗證

圖1 回歸模型驗證

3 結論

3.1利用響應面法優(yōu)化獲得固定化脂肪酶非水相催化合成油酸甲酯的最佳體系為：在每g油酸加入0.568g的固定化脂肪酶及3.3mL的正己烷，油酸與甲醇摩爾比為1∶1.2。

3.1建立了二次響應面回歸方程Y1=94.44+1.22×X1- 0.74×X2-0.95×X3-0.02×X1×X1+0.40×X1×X2+0.13×X1×X3- 1.13×X2×X2-0.30×X2×X3+0.16×X3×X3，可以很好描述體系中酶添加量、有機溶劑量、底物摩爾比的三個因素對轉化率的影響。

3.3對響應面分析結果進行驗證試驗，最終實驗轉化率達到95.56%，與響應面預測值95.99%的吻合程度較高，說明利用響應面分析法進行優(yōu)化催化體系是成功的。

[1] 張呈平, 楊建明, 呂劍. 生物柴油的合成和使用進展[J]. 工業(yè)催化, 2005, 5 (13) : 9- 13.

[2] 黃小明, 謝文磊, 彭紅. 生物柴油的現(xiàn)狀和發(fā)展[J]. 精細石油化工, 2005, (1): 59- 61.

[3] 陳建平, 崔建兵, 鄭毅. 油酸甲酯酶法酯化合成的研究[J]. 福建師范大學學報: 自然科學版, 2008, 24（增刊）: 109-112.

[4] 陳建平. 堿性脂肪酶酶活測定的影響因素探討[J]. 福建師范大學學報:自然科學版, 2001, 17（增刊）: 24-27.

[5] 鄧利, 譚天偉, 王芳. 脂肪酶催化合成生物柴油的研究[J]. 生物工程學報, 2003, 19（1）: 97-101.

基金項目：福建省自然科學基金資助項目（2007J0217）。

通訊作者：鄭毅，Email：eyizheng@fjnu.edu.cn