周 林,邵龍義,劉君霞,宋曉焱 (中國礦業(yè)大學(xué)(北京)地球科學(xué)與測繪工程學(xué)院,煤炭資源與安全開采國家重點實驗室,北京 100083)

云南省宣威地區(qū)農(nóng)村的肺癌發(fā)病率居全國之首,其中尤以女性肺癌發(fā)病率高,在世界女性肺癌死亡率水平中亦屬前列[1-2].目前,國內(nèi)外學(xué)者對宣威肺癌高發(fā)原因及影響因素進行了一系列的研究,發(fā)現(xiàn)宣威農(nóng)村肺癌的高發(fā)病率與家庭使用煙煤高度相關(guān);吸煙并不能解釋宣威肺癌特殊的流行病學(xué)特征,吸煙者肺癌發(fā)病率和死亡率在肺癌高發(fā)區(qū)和地發(fā)區(qū)、男女之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義;以煙煤和木柴為生活燃料的家庭室內(nèi)可吸入顆粒物濃度高,宣威肺癌高發(fā)地區(qū)長期燃燒煤煙造成室內(nèi)以苯并芘(Bap)為主的多環(huán)芳烴類物(PAH)污染是宣威肺癌高發(fā)的主要原因之一;基因檢測研究表明,宣威肺癌患者中存在肺癌易感基因;宣威肺癌的產(chǎn)生可能與所使用的煙煤及其產(chǎn)物中所含的微纖維狀石英有關(guān)[3-11].

肺泡上皮細(xì)胞(AEC)是顆粒物接觸和沉積的最初靶細(xì)胞,是肺組織最有可能受到顆粒物的毒性損害的細(xì)胞,同時AEC在肺癌的發(fā)生中具有重要的作用[12].目前宣威肺癌的研究尚未有直接針對肺泡上皮細(xì)胞的研究,尤其是 PM10對肺泡上皮細(xì)胞的毒性損害研究,對于進一步研究肺癌發(fā)病機制具有重要意義.

本研究通過肺上皮細(xì)胞 A549建立PM10體外染毒模型,應(yīng)用Annexin V/PI雙染色FCM研究宣威肺癌高發(fā)地區(qū)室內(nèi)PM10對人肺泡上皮細(xì)胞A549的凋亡的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸亞鐵 D MEM 培 養(yǎng)液(Gibco,USA),胎牛血清(天津TBD公司),青鏈霉素(Invitrogen, USA),胰蛋白酶(Amresco,USA),臺盼藍(Sigma分裝,USA), 四甲基偶氮銼藍(MTT Amresco, USA),AnnexinV-FITC/PI試劑盒(北京寶賽公司),二甲基亞砜(DMSO Amresco,USA)等.實驗所用的人肺泡上皮細(xì)胞由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供.用含 l0%的胎牛血清和青鏈霉素雙抗 DMEM 養(yǎng)液,37℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng),細(xì)胞融合80%時,分別用0.5%和0.25%的胰蛋白酶消化,傳代用于實驗.

1.2 采樣地點

采樣地點之一的肺癌高發(fā)區(qū)虎頭村位宣威市近郊的來賓鎮(zhèn),海拔 1859.8m,位于虎頭山的北坡,背南風(fēng),空氣不流通,主導(dǎo)風(fēng)向為西南風(fēng),附近有長征煤礦、燕塘煤礦等 5家較大的煤礦,以品質(zhì)較低的煙煤為主.虎頭村村委會下轄 9個自然村,約4000多人,2007年有20多人死于肺癌,其中虎頭村最為嚴(yán)重,約10人左右死于肺癌.在虎頭村隨機選取3戶有肺癌患者家庭采樣,這3戶人家主要生活燃料是來自于附近煤礦的煙煤,日常做飯、取暖均使用采用開放式“火塘”,“火塘”沒有煙囪和爐橋,上口與地面平行.由于缺乏通風(fēng)裝置,室內(nèi)煙塵濃度很高,在一些家庭堂屋內(nèi)監(jiān)測到總懸浮顆粒物濃度可達20mg/m3.

作為對照的采樣點位于西澤鄉(xiāng)寧家灣村,屬于肺癌低發(fā)區(qū)域,距離宣威市區(qū) 30km左右,附近無煤礦及其他污染企業(yè),村民生活燃料普遍以木柴為主,少量使用無煙煤,采樣家庭有獨立廚房,有通向室外的煙囪.寧家灣村民呼吸系統(tǒng)疾病患病率低,2000年以來無肺癌患者.

1.3 樣品的采集及處理

采樣時間為2008年12月25日～2009年1月28日.其中虎頭村采樣22d,寧家灣村采樣7d.采樣儀器:KB80-E型采樣泵(青島嶗山電子),粒度切割器(Negretti,UK)以及孔徑為0.67μm,直徑為47mm 的聚碳酸酯濾膜(Millipore,USA).在客廳距地面 120cm放置采樣儀.采樣流量為30L/min,12h連續(xù)采集室內(nèi) PM10樣品,同時記錄采樣點溫度、氣壓、濕度、室內(nèi)生活狀況等要素.溫度和濕度由溫度/濕度監(jiān)測器(Oregon Scientific,UK)測得.采集部分樣品用于細(xì)胞染毒試驗.試驗樣品參數(shù)如表1所示.

表1 實驗樣品參數(shù)Table 1 Parameters of samples

將樣品干燥,用干凈消毒的手術(shù)剪稱重后的濾膜剪碎,置于15mL的潔凈離心管中,加入5mL HPLC級水(Fisher化學(xué)公司,UK),封口膜封口,放在渦旋振蕩器(Scientific Indus-tries,Vortex Genie 2)上輕輕振蕩6h,然后移出溶液,在濾膜中重新加入5mL HPLC級水,再一次振蕩6h,使顆粒物盡可能地從濾膜上分離開來,并將 2次振蕩的溶液移到一個離心管中;取出濾膜,在通風(fēng)櫥內(nèi)自然冷干后稱重,通過差減法得到振蕩下來的顆粒物的量;加入適量的HPLC級水顆粒物配成溶液,部分液體置于1.5mL的離心管中,在渦旋振蕩器上輕輕振蕩16h后,再超聲振蕩2min,以使樣品中的水溶部分充分溶解后即為顆粒物水溶液,4℃保存?zhèn)溆?分別配制成 0,25,50, 100,200μg/mL 5 個濃度的全樣溶液進行肺泡上皮細(xì)胞染毒試驗.

1.4 細(xì)胞凋亡試驗

從液氮罐中取出凍存的人肺上皮細(xì)胞A549,進行細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng),經(jīng)過細(xì)胞傳代,接種,計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度,將生長良好的指數(shù)生長期的A549細(xì)胞制成1×105的細(xì)胞懸液2mL,接種于6孔培養(yǎng)板,置于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱(Forma3110系列,USA)培養(yǎng)24h后,棄上清液,用D-Hanks液洗3次,加入含雙抗、不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,每組樣品設(shè)3個平行,培養(yǎng)20h.分別加入5個濃度等級的PM10溶液進行染毒,培養(yǎng)20h,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗2次,胰酶消化,細(xì)胞與原細(xì)胞培養(yǎng)液合并,4℃,1000r/min離心12min,細(xì)胞用PBS重新懸浮,1000r/min離心1min,倒掉上清液,用 200μL binding buffer懸浮細(xì)胞,過 200 目篩,加6μL 的 Annexin-V,避光靜置 15min,加 3μL 的碘化丙啶(PI),上流式細(xì)胞儀進行分析.

1.5 細(xì)胞計數(shù)與統(tǒng)計分析

采用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞計數(shù)分析.AnnexinV-FITC/PI雙染檢測法是目前較為理想的檢測細(xì)胞凋亡的方法[13].未發(fā)生凋亡細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)及功能完整,胞膜沒有被染上綠色熒光(FITC-),細(xì)胞核完整且未被染上紅色熒光(PI-);早期凋亡的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,但是因為“膜翻轉(zhuǎn)”而被染上紅色熒光(FITC+);但因為膜結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核未被染上紅色熒光(PI-);晚期凋亡細(xì)胞膜完整性破壞,PI通過細(xì)胞膜進入細(xì)胞,細(xì)胞膜“翻轉(zhuǎn)”不完整的胞膜被染上綠色熒光,胞核被染上紅色熒光(FITC+/PI+).在本試驗中,由于顆粒物的毒性損傷,導(dǎo)致早期細(xì)胞膜喪失不對稱性,細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)外露,早于DNA 斷裂[14],通過膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)與 PS特異性結(jié)合、PI與壞死細(xì)胞結(jié)合可區(qū)分凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞.

采用One-way-ANOVA進行凋亡率的計算,凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/10000)×100%.數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件的一般線性模型的Multivariate過程進行多元方差分析.

2 結(jié)果

表2是通過流式細(xì)胞儀檢測并計數(shù)得到的肺泡上皮細(xì)胞的凋亡率.

表2 PM10顆粒物懸浮液作用下A549總凋亡率(%)Table2 Apoptosis rate induced by PM10 solution(%)

方差齊性檢驗表明,虎頭村與寧家灣村 2組PM10樣本的Levene統(tǒng)計量為225.486(P＜0.001),可以認(rèn)為樣本所在各總體的方差齊.對不同來源、不同濃度的PM10下肺泡上皮細(xì)胞單因素方差分析,虎頭村組室內(nèi) PM10樣本對肺上皮細(xì)胞凋亡的影響與寧家灣組差異顯著(F=3124.522,P＜0.001),而且各組內(nèi)不同濃度對肺上皮細(xì)胞凋亡的影響差異顯著(P＜0.001).用 S-N-K 法進行兩兩比較,寧家灣村室內(nèi) PM10樣本在 25,50μg/mL濃度下肺泡上皮細(xì)胞死亡率沒有差異(P=0.671,P＞0.01);虎頭村室內(nèi) PM10樣本在25,50μg/mL濃度下對肺泡上皮細(xì)胞凋亡率沒有差異(P=0.026,P＞0.01);其余被歸入不同亞組(P＜0.001),表明對肺上皮細(xì)胞的死亡或凋亡有差異.由表 3可以看出,虎頭村組室內(nèi) PM10作用下肺上皮細(xì)胞死亡或凋亡率大于寧家灣組,2組樣本作用下細(xì)胞的凋亡率和死亡率,隨著的室內(nèi)PM10濃度增加而提高.

表3 組別與濃度主效應(yīng)交互作用結(jié)果Table 3 Analysis of the main effects interaction between groups and concentrations

3 討論

正常凋亡是由多基因嚴(yán)格控制的、遵循自身程序的主動、高度有序的過程,但如果細(xì)胞受到外界因素的干擾,則會影響細(xì)胞的凋亡過程,表現(xiàn)在細(xì)胞凋亡過程處于各周期細(xì)胞數(shù)量的變化.在本研究中,室內(nèi) PM10的誘導(dǎo)是肺泡細(xì)胞上皮細(xì)胞凋亡的病理條件,細(xì)胞計數(shù)分析顯示,細(xì)胞凋亡率隨著濃度增加而增加,組間對比,同一濃度下虎頭村凋亡率大于寧家灣組,具有顯著性差異(P＜0.001).在寧家灣村組內(nèi)比較,在較低濃度下(＜50μg/mL)PM10對肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響沒有差異.但濃度較高時,隨著濃度增加,細(xì)胞凋亡率明顯增加,這可能由于較高濃度下顆粒物的體積、顯微形貌、顆粒的聚集特性等理化性質(zhì)對細(xì)胞的凋亡有一定影響.PM10生物活性研究表明,虎頭村的PM10具有較強氧化性損傷能力[15],顆粒物自身的表面吸附的過渡金屬金屬等誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自由基,尤其是活性氧(ROS),它們會對細(xì)胞DNA造成顯著的傷害,引起DNA的單鏈或雙鏈斷裂.細(xì)胞凋亡存在的3條途徑:線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路均與 ROS密切相關(guān)[16],因此推斷,較強氧化性損傷能力可能是虎頭村PM10樣品影響肺泡上皮細(xì)胞的凋亡主要原因之一.

宣威肺癌產(chǎn)生機理至今尚不明確,室內(nèi)PM10組成和來源非常復(fù)雜,是多種污染物的載體和催化劑,包括多種PAHs及其衍生物、含氧雜環(huán)化合物、金屬元素及其化合物、硫酸鹽、硝酸鹽、各種生物氣溶膠等,致毒機理也并非一種機理能夠解釋.PM10影響肺組織細(xì)胞的凋亡,損害遺傳物質(zhì)和干擾細(xì)胞正常分裂,而長期接觸 PM10導(dǎo)致上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子增加;PM10污染物作用于細(xì)胞產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子如生長因子,可能導(dǎo)致細(xì)胞周期失去正常調(diào)節(jié),從而使細(xì)胞分裂增加,進一步形成肺癌.

4 結(jié)語

宣威肺癌高發(fā)區(qū)虎頭村室內(nèi)PM10對人肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響大于對照點肺癌低發(fā)區(qū)室內(nèi)PM10,可能是虎頭村肺癌高發(fā)的重要因素之一.因此改善居民居住環(huán)境和生活條件,控制室內(nèi)PM10的濃度,對降低虎頭村肺癌發(fā)病率具有積極作用.

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致謝：衷心感謝北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院趙曉紅教授對細(xì)胞實驗部分的指導(dǎo),感謝宣威市虎頭村衛(wèi)生室代普飛在采樣過程中給予的幫助.