陳 立,顧謙群

(1.福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院,福建福州350002;2.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

星座美洲海鞘次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究*

陳 立1,2,顧謙群2**

(1.福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院,福建福州350002;2.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

從采自青島近海的星座美洲海鞘(Amaroucium constellatum)70%乙醇提取物中分離得到9個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物。經(jīng)波譜(MS、NM R)分析和文獻(xiàn)比對(duì),確定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為尿嘧啶(1)、膽甾醇(2)、十九碳甘油醚(3)、胸腺嘧啶(4)、反-4-對(duì)羥基苯基-3-丁烯-2-酮(5)、反-4-苯基-3-丁烯-2-酮(6)、對(duì)胺基苯乙酸(7)、胸腺嘧啶脫氧核苷(8)和N-甲基尿嘧啶核苷(9)。其中,化合物2～3,5～7,9均為首次從該海鞘中分離得到。

星座美洲海鞘;次級(jí)代謝產(chǎn)物;結(jié)構(gòu)鑒定;抗腫瘤活性

自然界中已知有1 500余種海鞘,主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。近年來(lái)眾多研究表明,海鞘中含有許多結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要包括生物堿類(lèi)、肽類(lèi)、萜類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)以及多硫化合物等,生物活性有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)釋鈣物質(zhì)等。其中,最有代表性的當(dāng)屬抗腫瘤藥物海鞘素-743(ET-743),ET-743是從一種加勒比海鞘Ecteinascidia turbinata中發(fā)現(xiàn)的生物堿,是一種DNA結(jié)合藥物。它對(duì)各種實(shí)體瘤細(xì)胞系具有抗性,包括軟組織肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌以及黑色素瘤等[2]?，F(xiàn)已被歐盟承認(rèn)為治療軟組織肉瘤和卵巢癌的孤藥[3]。

我國(guó)海鞘資源豐富、種類(lèi)繁多,目前已發(fā)現(xiàn)有103種之多[4],僅有少數(shù)幾個(gè)種屬的海鞘的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了報(bào)道。其中,俎成立等從柄海鞘中發(fā)現(xiàn)了大量的甾類(lèi)衍生物、甘油酯、苯類(lèi)和堿基等[5-7];王超杰等從冠瘤海鞘中分離到甾類(lèi)、神經(jīng)酰胺、甘油醚、核苷等[8-9],從皺瘤海鞘中分離到甾類(lèi)和神經(jīng)酰胺等[10];王艷紅等也從長(zhǎng)紋海鞘中發(fā)現(xiàn)了膽甾醇和神經(jīng)酰胺[11];徐秀麗等從美洲海鞘(又稱(chēng)列精海鞘)正丁醇部分分離到5個(gè)堿基與核苷[12]?？梢?jiàn),目前國(guó)內(nèi)對(duì)海鞘來(lái)源天然產(chǎn)物及其相關(guān)生理活性的研究尚處于起步階段,對(duì)海鞘次級(jí)代謝產(chǎn)物及其活性進(jìn)行研究具有廣闊前景。

為了尋找結(jié)構(gòu)新穎的抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)青島及周邊海域多種海洋附著生物的抗腫瘤活性進(jìn)行了篩選。在篩選過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)星座美洲海鞘(Am aroucium constellatum,又稱(chēng)星座列精海鞘)的乙酸乙脂層萃取物在100μg/m L濃度下對(duì)小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡活性(見(jiàn)下圖),正丁醇層萃取物在100μg/m L濃度下對(duì)該細(xì)胞有細(xì)胞毒活性。于是決定對(duì)該海鞘的乙酸乙酯和正丁醇萃取物的化學(xué)成分分別進(jìn)行研究。

經(jīng)過(guò)大規(guī)模富集、乙醇提取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取以及各種柱層析,共分離得到9個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物。經(jīng)波譜(M S、NM R)分析和文獻(xiàn)比對(duì),確定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為尿嘧啶(1)、膽甾醇(2)、十九碳甘油醚(3)、胸腺嘧啶(4)、反-4-對(duì)羥基苯基-3-丁烯-2-酮(5)、反-4-苯基-3-丁烯-2-酮(6)、對(duì)胺基苯乙酸(7)、胸腺嘧啶脫氧核苷(8)、N-甲基尿嘧啶核苷(9)。其中,化合物2,3,5-7,9均為首次從該海鞘中分得[12]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

質(zhì)譜用Q-TOF UL TIMA GLOBAL GAAO76 LC型質(zhì)譜儀,核磁共振譜用日本JEOL JNM -ECP600型核磁共振儀測(cè)定。分析用高效液相色譜儀:Waters公司產(chǎn)品(Waters 600,Waters 996二極管陣列檢測(cè)器,M illennium32工作站,Capcell Pak C-18柱(4.6 mm×250 mm,5μm)。制備用高效液相色譜儀:日本島津公司產(chǎn)品,LC-6AD,SPD-M 20 AVP檢測(cè)器,SCL-10AV型系統(tǒng)控制器,Capcell Park C-18柱(10 mm×250 mm,5μm)。柱色譜及薄層色譜用硅膠H(10～40μm)(青島海洋化工集團(tuán)公司)。SephadexTML H-20(Pharmacia公司)。活性測(cè)試采用小鼠溫敏型乳腺癌tsFT210細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)采用美國(guó)BD公司Vantage型流式細(xì)胞儀。胎牛血清(FBS)和RPM I-1640細(xì)胞培養(yǎng)基分別為Hyclone公司(Cat.No.STF721)和Gibcobrl公司產(chǎn)品。麗絲胺羅丹明B(SRB,Sigma公司)。

1.2 海鞘的采集與處理

1.2.1 海鞘的采集與鑒定 該海鞘采自青島沿海潮間帶。經(jīng)中國(guó)科學(xué)院海洋研究所黃修明研究員鑒定為星座美洲海鞘(A maroucium constellatum)。

1.2.2 提取分離 將新鮮采集的海鞘(干質(zhì)量:5 kg)用勻漿機(jī)勻漿后,70%乙醇室溫浸提4次,濾液合并后減壓濃縮至無(wú)醇味。將濃縮液稀釋至10 L,依次用等體積乙酸乙酯和正丁醇分別萃取4次,濃縮后得乙酸乙酯層粗提物(15.2 g)和正丁醇層粗提物(18.9 g)。乙酸乙酯層粗提物經(jīng)硅膠減壓柱色譜石油醚-氯仿-甲醇體系洗脫得到3個(gè)組分。其中組分1再次經(jīng)硅膠加壓柱色譜石油醚-乙酸乙酯洗脫得化合物2(28.9 mg),3(15.2 mg);組分2經(jīng)凝膠柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)后高效液相制備得化合物5(35.7 mg),6(5.9 mg);組分3經(jīng)凝膠柱色譜(甲醇)后高效液相制備得化合物1(12.2 mg),4(15.4 mg)。正丁醇層粗提物經(jīng)硅膠減壓柱色譜氯仿甲醇洗脫后分成4個(gè)組分,其中組分2經(jīng)凝膠柱色譜(甲醇)得到化合物7(7.8 mg)、組分3經(jīng)凝膠柱色譜(甲醇)后高效液相制備得到化合物8(6.7 m g)和9(8.9 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色結(jié)晶,該化合物的陽(yáng)離子ESI-M S在m/z 225處給出[2M+H]+峰,在m/z 247,263處給出[2M+Na]+和[2M+K]+峰,結(jié)合1H-NMR數(shù)據(jù)確定其分子式為C4H4N2O2。1H-NMR(DMSO-d6)δ:11.03(1H,s,2-NH),10.84(1H,s,4-NH),7.40(1H,d,J=7.7Hz,H-5),5.44(1H,d,J=7.7Hz,H-6)與文獻(xiàn)[13]對(duì)照分析,可以確定化合物1為尿嘧啶。

化合物2 白色針狀結(jié)晶,Lieberman-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性,說(shuō)明該化合物是甾醇類(lèi)化合物。該化合物1HNMR譜在高場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)5個(gè)甲基信號(hào)δ0.68(3H,s);0.81(3H,d,J=6.6Hz);0.83(3H,d,J=6.9Hz);0.92(3H,d,J=6.6Hz);1.01(3H,s)。同時(shí)在δ5.35(1H,m)有1個(gè)sp2雜化氫質(zhì)子;δ3.52(1H,m)處有1個(gè)連氧的次甲基。與文獻(xiàn)[14]對(duì)照,確定該化合物為膽甾醇。

化合物3 白色粉末,該化合物的陰離子ESI-M S在m/z 357處給出[M-H]-峰,結(jié)合1H NM R和13C NM R數(shù)據(jù)確定其分子式為C22H46O3。1H-NMR(CDCl3)δ:3.68(2H,m,H-1),3.87(1H,m,H-2),3.51(2H,m,H-3),3.45(2H,m,H-1’),1.58(2H,m,H-2’),1.25-1.30(32H,m,H-3’-18’),0.88(3H,t,J=6.9Hz,H-19’),2.51(2H,brs,OH);13C-NM R(CDCl3)δ:71.8(t,C-1),70.4(d,C-2),64.2(t,C-3),72.5(t,C-1’),31.9(t,C-2’),22.7-29.7(t,C-3’-18’),14.1(q,C-19’)。結(jié)合文獻(xiàn)[15],該化合物為1-十九碳甘油醚。

化合物4 淡黃色針晶,該化合物的ESIM S在m/z 253處給出[2M+H]+峰,在m/z 275處給出[2M+Na]+峰,結(jié)合1H NM R和13C NM R數(shù)據(jù)確定其分子式為C5H6N2O2。1H-NM R(CD3OD)δ:7.22(1H,s,H-6),1.84(3H,s,H-7);13C-NM R(CD3OD)δ:153.7(s,C-2),167.5(s,C-4),110.4(s,C-5),139.2(d,C-6),12.1(q,C-7)。與文獻(xiàn)[14]對(duì)照分析,可以確定化合物4為胸腺嘧啶。

化合物5 淡黃色粉末,該化合物的陰離子ESI-M S在m/z 161處給出[M-H]-峰,結(jié)合1H NM R和13C NM R數(shù)據(jù)確定其分子式為C10H10O2。1H-NMR(CDCl3)δ:2.40(3H,s,H-1),6.61(1H,d,J=16.1Hz,H-3),7.52(1H,d,J=16.1Hz,H-4),7.45(2H,d,J=8.5Hz,H-2’,H-6’),6.92(2H,d,J=8.5Hz,H-3’,H-5’),7.66(1H,brs,OH);13C-NM R(CDCl3)δ:27.2(q,C-1),200.2(s,C-2),124.2(d,C-3),144.9(d,C-4),126.3(s,C-1’),130.4(d,C-2’,C-6’),116.2(d,C-3’,C-5’),159.0(s,C-4’)。結(jié)合文獻(xiàn)[16],可以確定化合物5為反-4-對(duì)羥基苯基-3-丁烯-2-酮。

化合物6 淡黃色粉末,該化合物的陽(yáng)離子ESI-M S在m/z 169處給出[M+Na]+峰,結(jié)合1H NM R數(shù)據(jù)確定其分子式為C10H10O。1H-NM R(CDCl3)δ:2.39(3H,s,H-1),6.58(1H,d,J=15.8Hz,H-3),7.53(1H,d,J=15.8Hz,H-4),7.40(2H,d,J=7.8Hz,H-2’,H-6’),7.25(2H,t,J=7.8Hz,H-3’,H-5’),7.32(1H,t,J=7.8Hz,H-4’),結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[17],可以確定化合物6為反-4-苯基-3-丁烯-2-酮。

化合物7 白色晶體,陰離子ESIM S給出分子離子峰[M-H]-m/z:150,由于1H NM R(CD3OD)只有3個(gè)氫信號(hào),判斷該化合物為對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu),核磁僅給出了一半的信號(hào)。1H NMR顯示7.01(1H,d,J=7.6 Hz)和6.53(1H,d,J=7.6 Hz)各有1組雙重峰,提示分子中存在對(duì)位取代苯環(huán)。此外還有1個(gè)亞甲基(1H,3.35,s)。結(jié)合文獻(xiàn)[18],分析該化合物為:對(duì)-胺基苯乙酸?；衔? 無(wú)色針晶,熔點(diǎn)186～187℃,陽(yáng)離子ESIM S在m/z 243處給出準(zhǔn)離子峰[M+H]+,在m/z 265處給出準(zhǔn)離子峰[M+Na]+,推測(cè)分子式為C10H14N2O5。1H NM R(CD3OD)δ:1.87(3H,d,J=0.9Hz,5-M e),7.81(1H,d,J=0.9Hz,H-6),6.27(1H,t,J=6.9Hz,H-1’),2.22(2H,m,H-2’),4.39(1H,m,H-3’),3.89(1H,m,H-4’),3.72(1H,dd,J=11.9,3.7Hz,H-5a’),3.78(1H,dd,J=12.3,3.3Hz,H-5b’);13C-NMR(CD3OD)δ:152.4(s,C-2),166.4(s,C-4),111.5(s,C-5),12.4(q,5-Me),138.2(d,C-6),86.2(d,C-1’),41.2(t,C-2’),72.2(d,C-3’),88.8(d,C-4’),62.8(t,C-5’)。綜合以上信息并與文獻(xiàn)[14]對(duì)照,確定該化合物為胸腺嘧啶-2′-脫氧核苷。

化合物9 白色晶體。陽(yáng)離子ESI-M S給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 259[M+H]+,提示其分子量為258,與分子式C10H14N2O6相符。1H NM R(CD3OD)δ:5.69(1H,d,J=8.4Hz,H-1),8.01(1H,d,J=8.4Hz,H-2),3.59(3H,s,H-7),5.89(1H,d,J=4.5Hz,H-1’),4.16(1H,overlapped,H-2’),4.16(1H,overlapped,H-3’),3.99(1H,m,H-4’),3.72(1H,dd,J=11.5,3.5Hz,H-5a’),3.82(1H,dd,J=11.5,3.5Hz,H-5b’)。結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù),對(duì)照文獻(xiàn)[19]可以確定該化合物為N-甲基尿嘧啶核苷。

2.2 抗腫瘤活性測(cè)試

根據(jù)之前本實(shí)驗(yàn)室對(duì)核苷類(lèi)化合物的抗腫瘤活性篩選報(bào)道[20]:化合物8(胸腺嘧啶-2′-脫氧核苷)在100 μg/m L時(shí),對(duì)tsFT210細(xì)胞抑制率達(dá)77.24%;在50 μg/m L時(shí)抑制率為26.43%;在25μg/m L時(shí)為10.22%。

2.3 討論

通過(guò)本項(xiàng)研究,首次從該海鞘中分離得到化合物2～3,5～7,9,并率先對(duì)其乙酸乙酯層成分進(jìn)行報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,星座美洲海鞘的乙酸乙酯層和正丁醇層粗提物主要成分是核苷類(lèi)化合物和苯的衍生物。核苷類(lèi)化合物是臨床治療血液性惡性腫瘤和實(shí)體腫瘤的基本藥物,目前應(yīng)用于臨床的和正在研究的核苷類(lèi)抗腫瘤藥物有數(shù)十種。它們主要作用是干擾腫瘤的DNA合成、影響核酸的轉(zhuǎn)錄過(guò)程、抑制蛋白質(zhì)的合成等,從而達(dá)到治療腫瘤的效果。例如:治療急性粒細(xì)胞白血病的阿糖胞苷以及治療肝癌、胃癌、乳腺癌的5-氟尿嘧啶等。據(jù)此推測(cè),核苷類(lèi)化合物應(yīng)該是該動(dòng)物粗提物抗腫瘤活性的主要成分。

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Chemical Study on Secondary Metabolites from Ascidian Amaroucium constellatum

CHEN Li1,2,GU Qian-Qun2
(1.Institute of Biomedical and Pharmaceutical Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350002,China.2.Key Laboratory of Marine Drugs,Ministry of Education,School of Medicine and Pharmacy,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Nine compounds were isolated from 70%alcohol extract of ascidia Amaroucium constellatum,collected from Qingdao sea area,China.Their structures were elucidated by various spectral analysis(M S,NM R)and comparison of their chemical and physical data with samples reported in literatures.Compounds 2～3,5～7 and 9 were first reported to be isolated from Ascidia Amaroucium constellatum.

Am aroucium constellatum;secondary metabolites;structure determination;antitumor

Q591

A

1672-5174(2010)12-111-04

國(guó)際合作重點(diǎn)項(xiàng)目(2005DFA 30030-4)資助

2010-06-04;

2010-09-29

陳 立(1981-),男,博士,助理研究員。E-mail:cli81cli81@163.com

**通訊作者:E-mail:guqianq@ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 徐 環(huán)