張甦，曲彤旭

（黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學(xué)院 食品工程系，哈爾濱 150000）

添加雙歧桿菌的干酪

張甦，曲彤旭

（黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學(xué)院 食品工程系，哈爾濱 150000）

雙歧桿菌是對人體有益的微生物，干酪的環(huán)境有利于雙歧桿菌的長期存活；著重介紹了將雙歧桿菌加入到干酪方面的研究進(jìn)展以及干酪中雙歧桿菌的精確計數(shù)方法。

雙歧桿菌；干酪；計數(shù)

0 引 言

最近幾年，消費(fèi)者對食品的安全和質(zhì)量產(chǎn)生了極大的關(guān)注?，F(xiàn)在消費(fèi)者不只關(guān)心食品的安全和營養(yǎng)價值，而且關(guān)心這些食品是否具有促進(jìn)健康的功效。消費(fèi)者的這種態(tài)度促進(jìn)了功能性食品的發(fā)展。含益生菌的食品是功能食品中的一類。Guarner和Schaafsma將益生菌定義如下：“益生菌是某些具有活性的微生物，它們以一定數(shù)量攝入時，除能產(chǎn)生固有基本營養(yǎng)價值外，還能對人類產(chǎn)生促進(jìn)健康的益處”[1]。富含益生菌的發(fā)酵乳制品是研究最多且最優(yōu)的功能食品之一。

雙歧桿菌和乳桿菌是人類食品中最適合用作益生菌的微生物。目前許多具有特定功效的乳桿菌菌株已經(jīng)用于發(fā)酵乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)中，但在這個領(lǐng)域雙歧桿菌還沒有廣泛地使用。由此，我們可以預(yù)料到含有雙歧桿菌的食品的研制和市場將持續(xù)增長。本文討論了益生菌食品中雙歧桿菌的推薦值、干酪作為雙歧桿菌載體的優(yōu)點(diǎn)、各種雙歧桿菌在不同類型干酪中的存活能力以及干酪中雙歧桿菌的計數(shù)[2]。

1 益生菌食品中雙歧桿菌的推薦量

雙歧桿菌在食用時必須是活菌，在通過胃腸道時

必須保持存活能力，只有這樣它們才能對人體產(chǎn)生健康功效。食品中雙歧桿菌的推薦量還沒有完全確定下來。不同的人提出的推薦量有很大的差別。Shah等人提出的推薦量為105cfu/g，Robinson等、Arroyo等和Rybka等提出的推薦量是106cfu/g，Samona和Robinson提出的推薦量是107cfu/g[3,4]。最重要的是，每日攝入的雙歧桿菌量需能達(dá)到應(yīng)有的治療效果。Blanchette等提出為了產(chǎn)生健康功效，每天攝入的益生菌數(shù)量約為108～109cfu/mL。 如果每天攝入100 g或100 mL的益生菌食品，該食品中至少應(yīng)含有106～107cfu/g或106～107cfu/mL[5]。

2 干酪作為雙歧桿菌載體的優(yōu)點(diǎn)

商業(yè)領(lǐng)域大多采用發(fā)酵乳和酸奶作為雙歧桿菌的食品載體。在酸奶中雙歧桿菌的存活性很差，這說明這些產(chǎn)品并不能很好地保持雙歧桿菌的存活能力。與發(fā)酵乳和酸奶相比，干酪更加適合作為雙歧桿菌的食品載體。

干酪作為雙歧桿菌食品載體的優(yōu)勢有：①與發(fā)酵乳和酸奶相比，干酪具有較高的pH值，發(fā)酵乳和酸奶的pH值為3.7-4.3，而干酪的pH值在4.8-5.6，因此干酪更加支持酸敏感性雙歧桿菌的長期存活[6]。②干酪內(nèi)部微生物的代謝使其內(nèi)部在成熟幾星期后形成幾乎完全厭氧的環(huán)境，這支持雙歧桿菌和其它厭氧性微生物的生長。③干酪的基質(zhì)和其相對較高的脂肪含量在通過胃腸道時為益生菌提供保護(hù)作用。④形成干酪特有風(fēng)味的乳酸細(xì)菌也促進(jìn)雙歧桿菌的生長和存活，它們通過改變pH值、改變生長因子和抑制因子的含量以及改變干酪的氧含量來影響雙歧桿菌的生長。Streptococcus thermophilus的某些菌株代謝氧氣的活性很高，Okonogi等已經(jīng)證實(shí)它們能增加雙歧桿菌的存活數(shù)量[7]。⑤干酪制作的特殊工藝也可能增加雙歧桿菌在干酪中的存活數(shù)量。雙歧桿菌的蛋白質(zhì)水解能力很差，這降低了它們在乳中的生長速度。干酪制作時加入的凝乳酶和發(fā)酵劑作用于酪蛋白所產(chǎn)生的副-κ-酪蛋白和其它酪蛋白水解產(chǎn)物可以作為雙歧桿菌的生長促進(jìn)因子[8]。

干酪作為雙歧桿菌載體也有不利的條件。凝塊的腌制是各種干酪生產(chǎn)的一個共同步驟。加鹽不僅增加干酪的風(fēng)味，而且影響其中微生物的生長，雙歧桿菌的存活數(shù)量與鹽含量呈負(fù)相關(guān)[9]。

3 雙歧桿菌的不同菌株在干酪中的存活能力

雙歧桿菌已經(jīng)成功地應(yīng)用到了很多類型的干酪中（見表1）。有幾個因素決定著雙歧桿菌在干酪中的存活能力，其中包括雙歧桿菌的菌株、干酪制作所用的發(fā)酵劑、干酪的成分以加工成熟條件[10]。

雙歧桿菌不同菌株的營養(yǎng)需求、生長性質(zhì)和代謝活性是不同的。因此，雙歧桿菌不同菌株表現(xiàn)出不同的存活能力，對乳制品的感官性質(zhì)也有不同的影響[11]。另外，為了確保雙歧桿菌經(jīng)過胃腸道時仍保持活性，需要篩選出對低pH和膽鹽具有高耐受性的人源雙歧桿菌[12]。下面將比較雙歧桿菌的幾個菌株在各種類型干酪中的存活能力。

O’Riordan和Fitzgerald將長雙歧、短雙歧、鏈狀雙歧、兩歧雙歧、角雙歧和嬰兒雙歧加入到農(nóng)家干酪中。冷藏14天后，各種雙歧桿菌活菌數(shù)的下降程度是不同的。兩歧雙歧的存活能力最好，數(shù)量的下降幾乎可忽略不計，而嬰兒雙歧和短雙歧存活能力很差，整個儲存期間數(shù)量下降了3個對數(shù)周期。

Gobbetti比較了Crescenza干酪中兩歧雙歧、長雙歧和嬰兒雙歧的存活能力。雙歧桿菌與發(fā)酵劑同時加入，按Crescenza干酪的標(biāo)準(zhǔn)加工工藝進(jìn)行加工。在14天成熟期內(nèi)，兩歧雙歧和長雙歧的活菌數(shù)增加了1到2個對數(shù)周期，而嬰兒雙歧的活菌數(shù)下降了1個對數(shù)周期。Gobbetti等推測嬰兒雙歧數(shù)量下降的原因是由嗜熱鏈球菌在發(fā)酵乳時快速產(chǎn)酸所致[13]。含有雙歧桿菌的干酪中乙酸和乳酸含量較高，但是干酪感官性質(zhì)的差別很小，這說明雙歧桿菌的代謝活性并不是很強(qiáng)。

Corbo等對Canestrato Pugliese（一種意大利硬質(zhì)干酪）中兩歧雙歧和長雙歧的存活能力進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)這兩種雙歧桿菌的存活能力存在著差別[14,15]。兩歧雙歧的活菌數(shù)比長雙歧高。35 d成熟期內(nèi)，兩種雙歧桿菌的活菌數(shù)是類似的，在成熟19天時，這兩個種的活菌數(shù)為107cfu/g，成熟35 d時它們的活菌數(shù)降到106cfu/g。然而，成熟56 d后兩歧雙歧的數(shù)量保持在106cfu/g，而長雙歧的數(shù)量下降到105cfu/g。

用全脂巴氏殺菌乳生產(chǎn)了四批伊朗白紋干酪，干酪使用酸奶發(fā)酵劑（嗜熱鏈球和德氏乳桿菌保加利亞亞種）或干酪發(fā)酵劑（乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種），另外還接種兩歧雙歧或青春雙歧，所有菌的接種量都為1%，這樣得到了四組含不同微生物的干酪[16]。青春雙歧在使用酸奶發(fā)酵劑和干酪發(fā)酵劑時都表現(xiàn)出較差的存活能力，它不適用于加到這種干酪中。然而，用酸奶發(fā)酵劑和兩歧雙歧生產(chǎn)的干酪成熟60 d后，雙歧桿菌的活菌數(shù)106cfu/g之上。兩歧雙歧比青春雙歧更耐受白紋干酪的鹽含量和酸度[17,18]。

El-Zayat和Osman將乳酸雙歧Bb-12和嗜酸乳桿菌La-5加入到Tallaga干酪中。他們先將牛乳標(biāo)準(zhǔn)化、巴氏殺菌，然后將益生菌加入到乳中。儲存28 d后，乳酸雙歧Bb-12和嗜酸乳桿菌La-5的活菌數(shù)都大于106cfu/g[19]。

表1 添加雙歧桿菌的干酪

M.philips等為了研究益生菌在切達(dá)干酪中的存活能力，生產(chǎn)了3種含雙歧桿菌的切達(dá)干酪，一種干酪含嗜酸乳桿菌L10、乳酸雙歧B94、副干酪乳桿菌L26，另一種干酪含嗜酸乳桿菌La5、干酪乳桿菌Lc1、乳酸雙歧Bb12，第三種含雙歧桿菌DR10和鼠李糖乳桿菌DR20。益生菌和干酪發(fā)酵劑同時加入。在成熟4周時，B94數(shù)量有所下降，DR10數(shù)量沒有產(chǎn)生變化，Bb12數(shù)量上升[19,20]。之后這三株雙歧桿菌的數(shù)量都呈上升趨勢，在第12周時數(shù)量達(dá)到最大值。在第12周到32周之間，它們的數(shù)量有少量的下降。成熟期結(jié)束（第32周）時，B94、Bb12和DR10的數(shù)量分別為4×107、1.4×10、和5×108。

Ong等在另一個研究中生產(chǎn)了兩種益生菌干酪，第一種含嗜酸乳桿菌4962、干酪乳桿菌279、長雙歧1941，第二種含嗜酸乳桿菌LAFTIL10、副干酪乳桿菌LAFTIL26、乳酸雙歧LAFTIB94。成熟24周后，長雙歧1941的數(shù)量為108，乳酸雙歧LAFTI B94的數(shù)量為3.2×107[21-23]。

為了保持雙歧桿菌在干酪中的存活能力，必須嚴(yán)格地篩選菌株。在評價了上述幾種類型干酪中雙歧桿菌的存活能力之后，可看出兩歧雙歧和長雙歧通過干酪加工和儲存后表現(xiàn)出良好的存活能力。然而，嬰兒雙歧和青春雙歧的存活能力很差，不適于加入到乳制品中。

4 加工工藝對雙歧桿菌存活能力的影響

除了根據(jù)不同品種的干酪選擇不同菌株之外，了解加工工藝對雙歧桿菌存活能力的影響也是非常重要的。硬質(zhì)或半硬質(zhì)干酪加工成熟過程中的加溫攪拌、需氧環(huán)境、發(fā)酵劑、成熟和儲存溫度都可能對雙歧桿菌的存活能力產(chǎn)生影響[24,25]。干酪的加工工藝必須保持雙歧桿菌的活力，但是不能使雙歧桿菌過量生長和產(chǎn)酸，過量生長和產(chǎn)酸會對發(fā)酵乳制品的感官性質(zhì)產(chǎn)生不利影響[25]。下面討論干酪的加工工藝對雙歧桿菌活菌數(shù)的影響。Gomes等在生產(chǎn)添加Bifidobacterium ssp.strain Bo和L.acidophilus的高達(dá)干酪時，調(diào)整了高達(dá)干酪的制作工藝[26]。在干酪制作結(jié)束時，雙歧桿菌代謝產(chǎn)生乙酸，但活菌數(shù)沒有顯著增加，L.acidophilus的活菌數(shù)增加了一個對數(shù)周期。然而儲存9周后，L.acidophilus的菌數(shù)下降了2個對數(shù)周期，而雙歧桿菌的活菌數(shù)下降了不到一個對數(shù)周期。整個成熟期內(nèi)這兩種菌的活菌數(shù)都高于107，成熟九周后雙歧桿菌的活菌數(shù)決定于干酪的不同部分、鹽濃度以及是否添加蛋白水解產(chǎn)物[27,28]。干酪中鹽含量范圍為1.90%到3.90%的部分雙歧桿菌存活率為55%-35%，在干酪的中央部分雙歧桿菌活菌數(shù)最高，因?yàn)橹醒氩糠值难鹾亢望}含量最低。為了增加雙歧桿菌的生長，在干酪加工期間添加蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，但它們并沒有顯著增加雙歧桿菌的活菌數(shù)。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物增加游離氨基酸和肽的含量，以較低含量添加時它們也會給干酪?guī)聿涣嫉娘L(fēng)味。

Blanchette在制作含益生菌的農(nóng)家干酪時，先將奶油調(diào)味料巴氏殺菌、冷卻至37℃，接種3%的B.infantis，將調(diào)味料發(fā)酵至pH達(dá)到4.5-6.0之間，然后將奶油調(diào)味料與用傳統(tǒng)加工工藝生產(chǎn)的干酪凝塊混合[28,29]。在儲存10 d內(nèi) （這是農(nóng)家干酪的正常儲存期），B.infantis存活得很好，活菌數(shù)沒有顯著變化，這是因?yàn)檎{(diào)味料的pH值比較高。然而儲存10 d后，雙歧桿菌的數(shù)量快速下降，到第28 d時，已檢測不到雙歧桿菌[29]。

Dinakar and Mistry在反轉(zhuǎn)堆積前或加鹽前，將未固定化或固定化的兩歧雙歧冷凍干燥菌粉加入到切達(dá)干酪凝塊中。這兩種方法所生產(chǎn)的干酪中，雙歧桿菌的活菌數(shù)都高于107，在整個24周儲存期內(nèi)，雙歧桿菌沒有表現(xiàn)出旺盛的代謝活性。雙歧桿菌的加入沒有影響切達(dá)干酪的風(fēng)味、組織狀態(tài)或外觀[29]。

干酪制作過程中，發(fā)酵劑乳酸細(xì)菌產(chǎn)生抑制益生菌的物質(zhì)，而且它們比益生菌長得快，所以益生菌的活菌數(shù)被降低了。先用益生菌發(fā)酵2 h，再加入發(fā)酵劑來發(fā)酵，這種方法有助于改善益生菌的存活能力，提高益生菌的活菌數(shù)。用此方法制作含L.acidophilus 2409和長雙歧1941的干酪，結(jié)果確實(shí)如此[27]。

Daigle等生產(chǎn)切達(dá)干酪時，先將牛乳脫脂，然后在奶油中接種嬰兒雙歧進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后加回到脫脂乳中，然后接種乳球菌發(fā)酵劑。奶油中雙歧桿菌代謝所生成的乙酸和乳酸降低了凝乳所需的時間。整個12周儲存期間，雙歧桿菌的數(shù)量沒有明顯改變，維持在大于106。在儲存期間，雙歧桿菌保持代謝活性，但沒有對干酪的感官性質(zhì)和成分產(chǎn)生不利影響[28]。

Gobbetti等將雙歧桿菌用藻酸鈣固定后加入到Crescenza干酪中，然后將所生產(chǎn)的干酪與用未固定化雙歧桿菌生產(chǎn)的干酪比較，前者沒有顯著影響雙歧桿菌的活菌數(shù)[29,30]。與此相似，Dinakar and Mistry在切達(dá)干酪中加入未固定化的兩歧雙歧冷凍干酪粉末或者加入用κ-鹿角菜膠固定化的兩歧雙歧冷凍干燥粉末，然后比較兩種方法所生產(chǎn)的切達(dá)干酪中雙歧桿菌的生長和存活能力[27]。儲存24周期間，用這兩種方法生產(chǎn)的干酪中雙歧桿菌的數(shù)量都提高了1-2個對數(shù)周期。固定化的制備方法保護(hù)細(xì)菌在成熟期間不受降解。使用未固定化的菌粉時，在18周時雙歧桿菌達(dá)到最大菌數(shù)。使用固定化的菌粉時，在24周達(dá)到最高菌數(shù)[31,32]。

加工后，包裝材料的選擇進(jìn)一步對雙歧桿菌的活菌數(shù)產(chǎn)生顯著影響。已證實(shí)PVDC和EVOH之類氧阻隔性好的包裝材料比聚乙烯和聚苯乙烯（這兩種材料是食品工業(yè)廣泛使用的包裝材料）之類的材料能更有效地保持雙歧桿菌的活菌數(shù)[33]。

5 干酪中雙歧桿菌的計數(shù)

雙歧桿菌在干酪中的存活是一個難題，但干酪中雙歧桿菌的計數(shù)也是一個難題。目前還沒有檢測干酪和其它乳制品中雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，這對益生菌食品的質(zhì)量控制及建立益生菌食品的官方標(biāo)準(zhǔn)并實(shí)時檢測造成了困難。因此，開發(fā)快速、可靠的方法對雙歧桿菌進(jìn)行選擇性計數(shù)對乳品工業(yè)已經(jīng)變得特別重要[33]。

乳酸細(xì)菌的傳統(tǒng)表型鑒定方法特別費(fèi)時費(fèi)力，而且不是完全可靠。用表型鑒定法不易將某些種的乳酸細(xì)菌區(qū)分開來。表型反應(yīng)也受到環(huán)境條件的影響。當(dāng)同一個種的不同菌株加入到干酪中時，傳統(tǒng)的菌落計數(shù)方法根本不能將它們區(qū)分開來。

當(dāng)在干酪發(fā)酵劑存在的情況下對雙歧桿菌進(jìn)行選擇性計數(shù)或鑒別性計數(shù)時，特別是當(dāng)使用培養(yǎng)基對某個菌株進(jìn)行菌落計數(shù)而這個菌株與設(shè)計這種方法時使用的菌株不是同一株時，所提出的培養(yǎng)基并非都能得到良好的結(jié)果。

MRS瓊脂常常用來對發(fā)酵乳制品中的乳酸細(xì)菌和益生菌進(jìn)行計數(shù)，當(dāng)雙歧桿菌是發(fā)酵乳制品中唯一的活菌時，它是非常有效的[32]。為了增加雙歧桿菌的選擇性、抑制其它乳酸細(xì)菌的生長，經(jīng)常在培養(yǎng)基中加入抑制劑和補(bǔ)充物質(zhì)[34]。表2列出了幾種用于干酪中雙歧桿菌計數(shù)的常用選擇性或鑒別性培養(yǎng)基。雙歧桿菌和其它乳酸細(xì)菌菌落形態(tài)的差別也可用來區(qū)分菌落。

表2 用于干酪中雙歧桿菌計數(shù)的培養(yǎng)基

在其它乳酸細(xì)菌存在的情況下用傳統(tǒng)表型方法對雙歧桿菌進(jìn)行鑒定存在著問題，所以要開發(fā)其它方法。使用熒光PCR方法無需將細(xì)菌從食品中分離出來即可對該菌進(jìn)行鑒別和計數(shù)[34,35]。以PCR為基礎(chǔ)的分子學(xué)方法的發(fā)展將提供一種鑒定細(xì)菌的更為快速、可靠、精確的方法，這種方法的發(fā)展對于含雙歧桿菌和其它益生菌的產(chǎn)品的研制是非常關(guān)鍵的。

6 結(jié) 論

許多研究者將雙歧桿菌加入到不同類型的干酪中的研究表明，干酪非常適合作為雙歧桿菌的載體。然而，終產(chǎn)品中雙歧桿菌的活菌數(shù)應(yīng)達(dá)到106以上，只有達(dá)到這個數(shù)量益生菌食品才能起到益生效果。因此，針對不同品種的干酪如何選擇雙歧桿菌的不同菌株，如何改善或調(diào)整生產(chǎn)加工工藝，對改善終產(chǎn)品中雙歧桿菌存活性進(jìn)行研究是非常重要的。在今天的食品工業(yè)，含雙歧桿菌的干酪的成功研制將有助于更為健康的食品的發(fā)展。

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Probiotic cheese containing bifidobacteria

ZHANG Su，QU Tong-xu
（Heilongjiang Nongken Vocational College，Harbin 150000，China）

The bifidobacteria is the microorganism that is beneficial to the body.Cheese does provide the environment which can be conducive to the longterm survival of the bifidobacteria.This details introduces evolvement of research about the cheese added in the bifidobacteria and accurate method amounting the number of incorporation of bifidobacteria in cheese.

bifidobacteria;cheese;amount

Q93-3，TS252.53

B

1001-2230（2010）01-0043-05

2009-04-29

張甦（1976-），女，工程師，研究方向?yàn)槿槠肺⑸铩?/p>