高娃，于潔，烏蘭，艾日登才次克，孫志宏，劉文俊，孟和畢力格，孫天松，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

蒙古國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中部分乳桿菌16S rRNA-RFLP的分類

高娃，于潔，烏蘭，艾日登才次克，孫志宏，劉文俊，孟和畢力格，孫天松，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

采用16S rRNA-RFLP技術(shù)對(duì)分離自蒙古國(guó)烏蘭巴圖周邊地區(qū)酸馬奶中部分乳桿菌進(jìn)行分類和鑒定。結(jié)合HaeIII，AluⅠ和HinfⅠ三種限制性內(nèi)切酶RFLP的分析，將26株乳桿菌鑒定為L(zhǎng)actobacillus helveticus（18），actobacillus plantarum（7）和Lactobacillus casei（1）。在此基礎(chǔ)上采用了16S rRNA基因序列分析的方法對(duì)本研究的26株乳桿菌進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與16S rRNA-RFLP鑒定結(jié)果相吻合，表明此方法是一種快速、準(zhǔn)確用于大量乳桿菌分類和鑒定的方法。

乳桿菌；鑒定；16S rRNA基因；RFLP

0 引 言

乳桿菌是革蘭氏染色呈陽(yáng)性、過氧化氫酶陰性，無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)或很少運(yùn)動(dòng)，無(wú)鞭毛，細(xì)胞形態(tài)呈桿狀，發(fā)酵可利用糖類產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌[1]。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)乳桿菌屬的分類鑒定主要是以表型特征和生理生化特性為依據(jù)來(lái)判定其歸屬，但是這種方法對(duì)于乳桿菌屬的鑒定有其必然的局限性：首先耗時(shí)耗力，工作量大，很難適應(yīng)當(dāng)前快速發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計(jì)2007年乳桿菌屬有145個(gè)公認(rèn)的種及亞種[2]，并已每年新增10～20個(gè)新種的速度遞增。其次，主觀誤差比較大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。第三，對(duì)于大部分乳桿菌而言，表形特征和生理生化特性極其相似，僅僅依靠傳統(tǒng)的鑒定方法很難進(jìn)行有效的區(qū)分。隨著分子生物學(xué)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)以及基因水平的研究以其快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)逐漸被用于乳酸菌的分類鑒定[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株來(lái)源。26株分離自蒙古國(guó)烏蘭巴圖周邊地區(qū)酸馬奶中的乳桿菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌保藏中心提供（已完成傳統(tǒng)鑒定方法分類鑒定[4]）。

（2）標(biāo)準(zhǔn)菌株。Lactobacillus casei AS1.2435，Lacto-bacillus helveticus AS1.1877，Lactobacillus plantarum AS1.2437，Lactobacillus rhamnosusAS1.2134，Lactobacillusacidophilus AS1.1878，Lactobacillus fermentum AS1.1880，Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii ATCC 11842，LactobacillusanimalisATCC35046，Lactobacilluscoryniformissubsp.coryniformis AS 1.1879。

（3）試劑和儀器。MJ PTC 200梯度基因擴(kuò)增儀，UVP CDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶等。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌全基因組的提取

采用CTAB法和凍融法[5，6]相結(jié)合的方法來(lái)提取乳桿菌的基因組DNA。取適量供試菌株的菌體于1.5 mL離心管中，加入500 μL TE緩沖液（濃度為10 mmol/L的Tris·Cl和1 mmol/L的EDTA,pH=8.0） 充分振蕩均勻后置于液氮中凍結(jié)（約5 min），取出迅速放入65℃水浴5 min使其充分融化，重復(fù)凍融步驟4次后加入60 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS和10μL蛋白酶κ（質(zhì)量濃度為20 g/L）置于55℃水浴鍋中進(jìn)行消化；1 h后取出加入100 μL NaCl（濃度為5 mol/L）和80 μL CTAB/NaCl溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的CTAB和濃度為0.7 mol/L的NaCl）混勻后65℃水浴15 min；然后用苯酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）混合溶液抽提2次去蛋白，澄清的上清加等體積預(yù)冷的異丙醇和0.1倍體積濃度為3 mol/L的NaAc沉淀DNA，以12 000 r/min離心3 min后，去上清并用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗滌2次；自然風(fēng)干后溶于適量的TE緩沖液儲(chǔ)存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌16S rRNA基因的擴(kuò)增

16S rRNA基因擴(kuò)增引物采用通用引物[7，8]，正向引物為27f（對(duì)應(yīng)于Escherichia coil 8-27位堿基）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′；反向引物為1495r（對(duì)應(yīng)于Escherichia coil 1495-1515位堿基）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增片段約為1450bp。采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件：94℃5 min預(yù)變性；94℃1 min,58℃1 min,72℃2 min,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取2 μL產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶的選取

在核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)[9]搜索并下載所有公布的已知16S rRNA基因序列，通過NEBcutter V2.0[10]軟件，分別對(duì)已知序列菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行模擬電泳。通過對(duì)電泳圖譜的分析初步選出適合乳酸菌的核酸內(nèi)切酶。

1.2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增片段的限制性酶切分析

用選取的限制性內(nèi)切酶對(duì)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)總體積為20 μL，含2 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，2U的內(nèi)切酶和2 μL的10×反應(yīng)緩沖液。在酶的最適溫度下水浴3 h后，取4 μL酶切產(chǎn)物在5%的聚丙酰胺凝膠上150V電壓進(jìn)行電泳，銀染后掃描圖片，并進(jìn)行分析。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

26株乳桿菌的16S rRNA基因由上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)定的序列用BLAST在GenBank中搜索相近序列。將測(cè)序菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列首先使用ClustalX[11]將序列進(jìn)行完全比對(duì)，然后用Neighbor-joining法[12]取得序列的進(jìn)化距離。使用MEGA 4軟件[13]作出系統(tǒng)進(jìn)化樹，數(shù)據(jù)自展重抽樣次數(shù)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因的擴(kuò)增檢測(cè)

所有供試菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1500 bp處出現(xiàn)熒光條帶（如圖1）。說(shuō)明PCR產(chǎn)物為陽(yáng)性結(jié)果，且條帶清晰、唯一可適合于RFLP分析和16S rRNA基因測(cè)序。

圖116 S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

圖1中，1為IMAU20016；2為IMAU20019；3為IMAU20025；4為IMAU20006；5為IMAU20009；6為IMAU20020；7為IMAU20026；8為L(zhǎng)actobacillus helveticus AS1.1877；9為L(zhǎng)actobacillus casei AS1.2435；M為DL2000 marker。

2.2 限制性內(nèi)切酶的選取結(jié)果

采用NEBcutter V2.0軟件選出3種限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ和AluⅠ，酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是：HinfⅠ：5′-G/ANTC-3′；HaeⅢ：5′-GG/CC-3′；AluⅠ：AG/CT；模擬電泳圖譜表明較適用于乳桿菌的鑒定，由于HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ 酶切位點(diǎn)較少，菌株間有明顯差異。

2.3 16S rRNA基因限制性酶切結(jié)果

利用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ分別對(duì)26株乳桿菌和9株標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA片段進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后將標(biāo)準(zhǔn)菌株的實(shí)際電泳圖譜與模擬電泳圖譜相比，相同菌株的主要帶型相同，酶切結(jié)果如圖2所示。

圖2 部分菌株和9株標(biāo)準(zhǔn)菌株限制性酶切圖譜

圖2中，1為IMAU20016；2為IMAU20009；3為IMAU20019；4為IMAU20020；5為IMAU20025；6為IMAU20006；7為IMAU20026；8為L(zhǎng)actobacillus coryniformis subsp.coryniformis AS 1.1879；9為L(zhǎng)actobacillus rhamnosus AS1.2134；10為L(zhǎng)actobacillus acidophilus AS1.1878；11為L(zhǎng)actobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii ATCC 11842；12為L(zhǎng)actobacillus plantarum AS1.2437；13為L(zhǎng)actobacillus fermentum AS1.1880；14為L(zhǎng)actobacillus helveticus AS1.1877；15為L(zhǎng)actobacillus casei AS1.2435；16為L(zhǎng)actobacillus animalis ATCC 35046；M為DL2000 marker。

由圖2（a）可以看出，待測(cè)菌株中泳IMAU20016；IMAU20019；IMAU20025（道1，3，5）的帶型與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus helveticus、Lactobacillus acidophilus的帶型一致；IMAU20009；IMAU20020；IMAU20026（ 泳道2，4，7）的帶型只與Lactobacillus plantarum相同，所以初步將其歸為L(zhǎng)actobacillus plantarum。IMAU20006（泳道6）的帶型與標(biāo)準(zhǔn)菌Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus casei的帶型特別相似，所以可判定IMAU20025為其中的一種菌。

由圖2（b）可以看出，待測(cè)菌株中IMAU20016，IMAU20019，IMAU20025（道1，3，5）的帶型與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus helveticus的帶型一致，且與Lactobacillus acidophilus的帶型差異很大，故可判定其為L(zhǎng)actobacillus helveticus；IMAU20006（泳道6）的帶型只與Lactobacillus casei相同，而且和Lactobacillus rhamnosus的帶型有差異，所以將其初步鑒定為L(zhǎng)actobacillus casei。待測(cè)菌株中IMAU20009；IMAU20020；IMAU20026（ 泳道2，4，7）帶型與Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus plantarum，Lactobacillus animalis的帶型均很相近；但是AluⅠ酶切圖譜顯 示 待 測(cè) 菌 株 中IMAU20009，IMAU20020，IMAU20026（泳道2，4，7） 帶型只與Lactobacillus plantarum一致，所以初步鑒定其為L(zhǎng)actobacillus plantarum。

兩種酶切圖譜已經(jīng)初步將乳桿菌鑒定到種的水平，采用第三種限制性核酸內(nèi)切酶HaeⅢ的酶切圖譜（圖2（c）可以進(jìn)一步驗(yàn)證菌株的鑒定結(jié)果。結(jié)合HaeⅢ，AluⅠ和HinfⅠ進(jìn)行酶切，通過與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對(duì)，將26株乳桿菌鑒定為L(zhǎng)actobacillus helveticus（18/26），Lactobacillus plantarum（7/26）和Lactobacillus casei（1/26）。

孟和畢力格等[3]通過傳統(tǒng)鑒定方法形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)將這26株歸為18株L.acidophilus Group，7株L.plantarum和1株L.casei。這結(jié)果與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是完全一致，其中18株L.acidophilus Group在本研究中都鑒定為L(zhǎng).helveticus。因此，在此基礎(chǔ)上采用了16S rRNA基因序列分析的方法對(duì)本研究的26株乳桿菌進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 16SrRNA基因序列分析

將26株乳桿菌的16S rRNA基因序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的相應(yīng)序列進(jìn)行BLAST分析，比對(duì)后可知：18株待測(cè)乳桿菌與L.helveticus DSM20075的同源性都在99%以上，鑒定為L(zhǎng).helveticus；7株待測(cè)乳桿菌的16S rRNA基因序列與菌株L.plantarum JCM1149的同源性是100%，認(rèn)為這7株菌為L(zhǎng).plantarum；1株待測(cè)乳桿菌與L.casei ATCC393的同源性是99%，鑒定該菌株為L(zhǎng).casei。

2.5 測(cè)序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖326 株待測(cè)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

將這26株菌的16S rRNA序列用MEGA4軟件中的Neighbor-joining法繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹，并比較了它們之間的進(jìn)化距離，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出：從總體上可將其分為3個(gè)大群，即與IMAU20006與L.casei ATCC393歸 為 第 一 群 ；IMAU20009，IMAU20013，IMAU20024，IMAU20015，IMAU20020，IMAU20026，IMAU20029與L.plantarum JCM1149歸為第二群；余下的18株菌與L.helveticus DSM20075非常接近的歸為第三群。由第一群到第三群的16S rRNA序列分析結(jié)果與RFLP結(jié)果基相吻合。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用16S rRNA-RFLP技術(shù)可將這些乳桿菌快速、簡(jiǎn)便分類并準(zhǔn)確的將其鑒定到種的水平。實(shí)驗(yàn)中采用細(xì)菌通用16S rRNA引物擴(kuò)增效果較好，結(jié)果清晰可靠，條帶單一，有利于16S rRNA片段的酶切。對(duì)于乳桿菌選出的3種限制性內(nèi)切酶HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ酶切位點(diǎn)相對(duì)較少，聚丙烯酰胺凝較電泳后條帶清晰、簡(jiǎn)單便于分析，然而由于某些酶切位點(diǎn)處于16S rRNA的保守區(qū)域，所以有些不同菌株的酶切圖譜非常相近。如HinfⅠ酶切圖譜中Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus plantarum的條帶長(zhǎng)度與數(shù)量相同，無(wú)法對(duì)未知菌株IMAU20009，IMAU20020，IMAU20026進(jìn)行鑒定，但AluⅠ酶切圖譜中卻不同，能夠很容易將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus plantarum，因此對(duì)于乳桿菌的鑒定需要幾種酶互相補(bǔ)充。

從分類學(xué)的角度看，生理生化特征仍然是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)菌種鑒定最為常用的方法，然而不同種屬的乳桿菌培養(yǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)需求差異很小，所以采用傳統(tǒng)的鑒定方法很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定[15]。孟和畢力格等[5]通過傳統(tǒng)鑒定方法形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)將其中18株L.helveticus鑒定為L(zhǎng).acidophilus Group。這可能是由于兩類乳桿菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)中所發(fā)酵的糖很多是一樣的，僅在Cellobiose、Esculin、Salicin這三個(gè)糖的發(fā)酵中有明顯區(qū)別。L.helveticus不發(fā)酵這三種糖，而L.acidophilus Group發(fā)酵。由于這樣很小的差異，用人為的判斷是很難進(jìn)行準(zhǔn)確的歸類，然而16S rRNA-RFLP技術(shù)可以結(jié)合多種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。

[1]凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999.

[2]CLAESSON M J,VAN SINDEREN D，O'TOOLE P W.Lactobacillus phylogenomics-Towards a Rreclassification of the Genus[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2008，58,2945-2954.

[3]孫天松.中國(guó)新疆地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶的化學(xué)組成及乳酸菌生物多樣性研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[4]孟和畢力格,烏日娜,王立平,等.不同地區(qū)酸馬奶中乳桿菌的分離及其生物特性研究[J].中國(guó)乳品工業(yè),2004,32（11）：6-11.

[5]AUSUBE F M,BRENT R,KINGSTON R E,et al.Current Protocols in Molecular Biology,vol.3.John Wiley&Sons,Inc.ISBN O-471-50337-1.

[6]ZHOU J Z,BRUNS M A,TIEDJIE J M.DNA Recovery from Soil of Diverse Composition［J］.Applied and Environmental Microbiology,1996,62：316–322.

[7]MORA B,FORTINA MG,NICASTRO G,et al.Genotypic characterisation of thermophilic bacilli：a study on new soil isolates and several reference strains.Research in Microbiology,1998,149：711–722.

[8]JENSEN MA,WEBSTER JA,STRAUSS N.Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms.Applied and Environmental Microbiology,1993,59：943–952.

[9]Ribosomal Datebase Project,http：//rdp.cme.msu.edu/

[10]GIRAFFA G,LAZZI C,GATTI M,et al.Molecular typing of Lactobacillus delbrueckii of dairy origin by PCR-RFLP of protein-coding genes.International Journal of Food Microbiology,2003,82：163-172.

[11]THOMPSONJD,GIBSONTJ,PLEWNIAKF,etal.TheCLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Research,1997,25：4876-4882.

[12]SAITOU N,NEI M.The Neighbor-joining Method：A new method for reconstructing phylogenetic trees.Molecular Biology and Evolution,1987,4：406-425.

[13]TAMURA K,DUDLEY J,NEI M,et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0.Molecular Biology and Evolution,2007,24,1596-1599.

[14]Yu Jie,Sun Zhihong,Liu Wenjun,Zhang Jiachao,Sun Tiansong,Bao Qiuhua and Zhang Heping.Rapid identification of Lactic Acid Bacteria isolated from Home-made fermented milk in Tibet.Journal of General and Applied Microbiology,2009,.55（3）.

[15]JOSé LB,IGNACIO DB,Imanol RZ,et al.Sequencing of variable regions of the 16S rRNA gene for identification of lactic acid bacteria isolated from the intestinal microbiota of healthy salmonids.Compar.Microbiology and Infectious Diseases,2007,30,111-118.

Classify research of lactobacillus from traditional fermented milk in mongolia by 16S rRNA-RFLP methods

GAO Wa,YU Jie,WuLan,Airidengcaicike,SUN Zhi-hong,LIU Wen-jun,Menghebilige,
SUN Tian-song,ZHANG He-ping
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018,China）

In this study,Lactobacillus were rapid classified and identified by the combined method of 16S rRNA-RFLP and Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）.26 lactobacilli were were identified as Lactobacillus helveticus（18）,L.plantarum（7）and L.casei（1）by（RFLP）analysis using a set of restriction enzymes,AluI,HaeIII and HinfI.On this basis,these strains were determined by 16S rRNA gene sequences analysis.It was shown that 16S rRNA-RFLP was coincidence with the sequenced results.In conclusion,this method can be used as a quick and reliable classification and identification of lactobacilli.

lactobacilli；identification；16S rRNA gene；RFLP

Q939

A

1001-2230（2010）01-0004-04

2009-06-30

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（No.2006AA10Z345,2007AA10Z353），國(guó)家自然基金項(xiàng)目（No.30660135，30800861），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目。

高娃（1985-），女，碩士研究生，從事乳品微生物方面的研究。

張和平