姜侃，陳宇鵬，金燕飛，黃建鋒，陳小珍，張東雷

（1.浙江省質量技術監(jiān)督檢測研究院，杭州 310013；2.杭州博日科技有限公司，杭州 310053）

應用酶聯(lián)免疫法快速檢測乳品中β-內酰胺類抗生素殘留

姜侃1，陳宇鵬2，金燕飛1，黃建鋒1，陳小珍1，張東雷1

（1.浙江省質量技術監(jiān)督檢測研究院，杭州 310013；2.杭州博日科技有限公司，杭州 310053）

建立乳品中β-內酰胺類抗生素殘留酶聯(lián)免疫快速檢測方法。應用氨芐青霉素抗體，通過人工制備了氨芐青霉素（Amp）和辣根過氧化物酶（HRP）的結合物Amp-HRP，建立直接ELisa競爭法檢測β-內酰胺類抗生素，確定了各種β-內酰胺類抗生素的檢出限，并對檢測條件進行了優(yōu)化。檢測了已知陰性和陽性的生鮮牛乳樣品，結果表明對于陰性和陽性牛奶樣品的檢測未出現(xiàn)假陽性或者假陰性結果。該方法檢測結果準確可靠，可廣泛應用于檢測乳品中β-內酰胺類抗生素殘留的檢測。

乳品；β-內酰胺類抗生素；殘留；酶聯(lián)免疫；競爭法

0 引 言

隨著生活水平的不斷提高，人們對食品安全要求更高，但青霉素等β-內酰胺類抗生素的大量使用導致許多動物源性食品，尤其是乳制品存在安全隱患[1]。β-內酰胺類抗生素的檢測方法中，理化檢測方法占主導地位，其中液相色譜-質譜聯(lián)用法因其高靈敏度、高選擇性，在藥物殘留檢測中的應用日趨普遍。但受設備要求高、操作復雜、檢測成本高等因素限制，無法得到廣泛應用。Elisa方法由于其靈敏度高、操作簡便快捷、分析成本低、前處理簡化、儀器化程度低、通量高等優(yōu)點，在食品成分分析中應用前景佳。本研究采用Elisa法測定乳品中β-內酰胺類抗生素的殘留，并對Elisa檢測條件進行了優(yōu)化，取得了滿意的效果，為探究快速檢測抗生素殘留的方法打下良好的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

酶標板，酶標儀，高速冷凍離心機，Amicon Ultra-4超濾管；氨芐青霉素抗體（Ampicillin Antibody，Amp-Ab），氨芐青霉素（Ampicillin），氨芐青霉素鈉（Ampicillin-Na），慶大霉素（Gentamicin），青霉素-G（Penicillin G），阿莫西林 （Amoxicillin），苯唑青霉素（Oxacillin），替卡西林（Ticarcillin），四環(huán)素（Tetracycline），鏈霉素（Streptomycin），氯霉素（Chloramphenicol），辣根過氧化物酶（HRP），氰尿酰氯（CC），四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。

1.2 Ampicillin-HRP結合物的制備

[3-5]中的方法制備Amp-HRP結合物。具體操作步驟：①稱取0.5mg的CC于離心管中，加入0.1mL丙酮后振蕩溶解，室溫下待丙酮完全蒸發(fā)后加入0.8 mL的HRP溶液（質量濃度為6 g/L，緩沖液濃度為0.05 mol/L,pH值為9.4的CBS溶液），室溫下反應2 h，將反應產物對濃度為0.05 mol/L（pH值為9.4）的CBS緩沖液4℃下透析過夜，其間換液1次。②將上述透析產物吸入離心管中，加入125 μL的Amp溶液（質量濃度為10 g/L，緩沖液濃度為0.05 mol/L，pH值為9.4的CBS溶液），37℃反應5 h，加入少量賴氨酸終止反應，將反應產物對濃度為0.015 mol/L（pH值為7.2）PBS緩沖液4℃下透析過夜，其間換液1次。③將透析產物用Amicon Ultra-4超濾管在高速冷凍離心機中超濾1次，去除游離Amp，超濾產物在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Amp-Ab最佳包被濃度的選擇

采用方陣滴定法，用包被液將Amp-Ab稀釋成1，2，4，6，10 mg/L五種質量濃度；100 μL/孔包被酶標板，4℃包被過夜；質量分數(shù)為0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌1次，加入200 μL質量分數(shù)為10%小牛血清，37℃封閉1 h；PBST洗滌3次，加入50 μL陰性和陽性的Amp標準品，再加入50 μL以1︰2500，1︰5000，1︰7500以及1︰10000稀釋的Amp-HRP，37℃溫育30 min；PBST洗滌5次，加入100 μL的TMB底物，室溫顯色15 min；用濃度為2 mol/L的HCl終止反應，再用酶標儀測定OD450，選擇最佳包被濃度。

1.4 Amp-Ab最佳包被條件的選擇

用Amp-Ab最佳包被濃度包板，按4℃和室溫25℃過夜兩種條件分別包被。將Amp-HRP以最佳稀釋度稀釋，用直接競爭Elisa法測定。

1.5 標準曲線的繪制及靈敏度計算

Amp-Ab用最佳包被濃度以及最佳包被條件包板，在質量分數(shù)為10%牛血清和空白生鮮牛乳樣本中分別配制氨芐青霉素鈉、青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素、替卡西林標準溶液，并在0，1，2，3，4，5，10，50，100，200 μg/L質量濃度下應用，Amp-HRP以最佳稀釋度稀釋，由競爭Elisa得到數(shù)據(jù)，每個測試做4孔平行，以專業(yè)數(shù)據(jù)處理軟件RIDAWIN處理數(shù)據(jù)分別繪制氨芐青霉素鈉、青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素、替卡西林等β-內酰胺類抗生素的標準曲線。參考相關文獻，抑制率達到10%的質量濃度為該種β-內酰胺類抗生素最低檢測限，抑制率達50%時的質量濃度比值為交叉反應率[6]。

1.6 非β-內酰胺類抗生素交叉反應率統(tǒng)計

在10%牛血清和空白生鮮牛乳樣本中分別配制質量濃度為1000 μg/L的慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素和氯霉素溶液。在β-內酰胺類抗生素中進行檢測分析，分析該檢測系統(tǒng)與非β-內酰胺類抗生素的交叉反應率。

1.7 定量分析乳品中的β-內酰胺類抗生素

用本β-內酰胺Elisa試劑盒檢測已知陰性生鮮牛乳樣品（樣品1～5）及已知含有相應質量濃度氨芐青霉素的生鮮牛乳樣品（樣品6～10）。具體操作：以抗生素檢測陰性的生鮮牛乳為基質，添加氨芐青霉素標準品配制成含不同質量濃度氨芐青霉素的生鮮牛乳，質量濃度分別為2，3，4，20，35 ng/mL； 由競爭Elisa獲得數(shù)據(jù)，每個測試做4孔平行，以專業(yè)數(shù)據(jù)處理軟件RIDAWIN處理數(shù)據(jù)。

2 結 果

2.1 Amp-HRP結合物的制備

Amp，HRP以及Amp-HRP的紫外掃描結果如圖1所示。由圖1可以看出，反應前Amp的特征吸收峰為206 nm左右，HRP的特征吸收峰為214 nm左右，結合反應后Amp-HRP的特征吸收峰為221 nm左右，因此Amp-HRP具有Amp和HRP吸收峰的重疊，根據(jù)UV的加和性[5]可知，Amp-HRP結合成功。

圖1 Amp，HRP以及Amp-HRP的紫外掃描結果

2.2 Amp-Ab最佳包被質量濃度的選擇

不同包被質量濃度的Amp-Ab和不同稀釋度的Amp-HRP作方陣滴定后的OD值如表1所示。由表1可以看出，在OD值接近1.0，N/P值在1.5以上并呈現(xiàn)最大者的包被質量濃度為6 mg/L，Amp-HRP的最佳稀釋度為1︰7500。

表1 Amp-Ab和Amp-HRP方陣滴定的OD值

2.3 Randox Ab最佳包被條件的選擇

Randox Ab在4℃和室溫25℃兩種條件下包板后，采用競爭Elisa測定的OD值，結果如表2所示。由表2可以看出，陰性信號較高，且N/P值比較大的最佳包被條件為4℃包被過夜。

2.4 氨芐青霉素免疫競爭法標準曲線的建立

Amp-Ab用最佳包被質量濃度（6 mg/L）以及最佳包被條件（4℃過夜）包板，Amp-HRP以1︰7500稀釋，直接競爭免疫反應后分別獲得以質量分數(shù)10%牛血清和空白生鮮牛乳為基質的標準品的檢測數(shù)據(jù)，如表3和表4所示；繪制的標準曲線由圖2和圖3所示。

表2 不同包被條件競爭Elisa檢測OD值

表3 以10%牛血清為基質的氨芐青霉素標準品檢測數(shù)據(jù)

表4 以生鮮牛乳為基質的氨芐青霉素標準品檢測數(shù)據(jù)

圖2 以10%牛血清為基質的檢測標準曲線

從標準曲線數(shù)據(jù)分析，當以質量分數(shù)為10%牛血清為基質時，抑制率達到10%時需要的氨芐青霉素的質量濃度為0.6 μg/L，即檢測限為0.6 μg/L；當以生鮮牛乳為基質時，抑制率達到10%時需要的氨芐青霉素的質量濃度為1.1 μg/L，即檢測限為1.1 μg/L。

圖3 以生鮮牛乳為基質的檢測標準曲線

從變異系數(shù)分析，當抗生素濃度處于相對較低或較高情況時，系統(tǒng)變異系數(shù)相對較高，提示已經接近該系統(tǒng)的檢測線性范圍。雖然在標準曲線各濃度點與實測濃度存在一定偏離度，但該系統(tǒng)檢測標準曲線線性良好，相關系數(shù)在99%以上，符合檢測要求。

2.5 其他β-內酰胺類抗生素檢測限及交叉反應率計算

以2.4所述方法，分別以質量分數(shù)為10%牛血清和生鮮牛乳繪制青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素和替卡西林檢測標準曲線并確定檢出限和交叉反應率。具體結果詳如表5所示。

表5 幾種β-內酰胺類抗生素檢出限

本實驗所嘗試的其他4種β-內酰胺類抗生素中，阿莫西林的交叉反應率最高，以質量分數(shù)為10%牛血清為基質時，交叉反應率高達86%；青霉素-G次之，以質量分數(shù)為10%牛血清為基質時，交叉反應率高達79%。因此，該檢測系統(tǒng)可作為β-內酰胺類抗生素的檢測系統(tǒng)。

2.6 定量分析模擬樣品及真實生鮮牛乳

對20種已知標示值的牛奶樣品采用通用免疫競爭法進行分析，結果見表5。表5中的結果證實，該免疫分析法可成功地用于檢測牛奶中的β-內酰胺類抗生素，已知陰性的牛奶經該法確認為陰性，已知陽性的牛奶經該法確認為陽性，進一步證實本實驗所建立的通用免疫競爭法可用于定量檢測牛奶中的β-內酰胺類抗生素。

3 結果與討論

β-內酰胺類抗生素是指具有β-內酰胺環(huán)的一類抗生素，在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常用于醫(yī)治奶牛的乳腺炎，因其廣譜性及其低廉的價格，常被頻繁地、超劑量地使用。殘留了抗生素的牛奶，被人飲用后，會導致不良反應。

表5 牛奶樣品1-20的檢測結果

目前牛奶中抗生素的檢測主要有以下幾種方法：① 微生物檢測法，如紙片法（PD）[7]、TTC法[8]等。 微生物檢測方法價格低，但操作復雜，檢測周期長，顯色狀態(tài)判斷易產生誤差。②理化檢驗法[9]，如高效液相色譜法及與質譜聯(lián)用法、薄層層析法、離子對色譜法、毛細管電泳法、比色法、熒光分光光度法等，但檢測程序較復雜，需專業(yè)的技術人員操作，且檢測成本較高，難以適應基層對牛奶抗生素檢測的需要。③免疫分析法[10]的基本原理是以抗原或半抗原和抗體特異性結合為抗原一抗體復合物的免疫反應為基礎的生化測試技術。免疫學檢測方法是目前公認的比較特異、靈敏的方法，而且其操作簡便，快速，越來越多地被用于動物性食品中抗生素殘留的檢測。

本研究以氨芐青霉素抗體為基礎，人工制備了氨芐青霉素和辣根過氧化物酶的結合物Amp-HRP，建立直接ELisa競爭法檢測β-內酰胺類抗生素。該檢測方法優(yōu)點有三：①檢測靈敏度高，當以生鮮牛乳為基質時，常用β-內酰胺類抗生素中氨芐青霉素和青霉素-G檢測限分別可達1.1和2.4 μg/L；② 特異性強，與非β-內酰胺類抗生素無交叉反應；③操作簡便，乳品樣本無需前處理，可直接應用于檢測，大大縮短檢測周期，提高實驗效率。

因此，該檢測系統(tǒng)可廣泛應用于我國各奶牛場、乳品企業(yè)以及食品安全監(jiān)控機構等對牛奶中β-內酰胺類藥物殘留的快速篩選與檢測。

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Application of enzyme-linked immunosorbent assay in detecting β-lactam antibiotic residues in dairy products

JIANG Kan1，CHEN Yu-peng2，JIN Yan-fei1，HUANG Jian-feng1，CHEN Xiao-zhen1，ZHANG Dong-lei1
（1.Zhejiang Test Academy of Quality and Technical Supervision,Hangzhou,310013,China;2.BIOER Technology CO.,LTD,Hangzhou,310053,China;）

Competitive enzyme-linked immunosorbent assay was use for developing a β-lactam antibiotics rapid detection method.The conjugate of ampicillin and HRP was synthesized,and direct competitive Elisa based on β-lactam antibiotics was set up and optimized.The detection limit of β-lactam antibiotics was also identified.Detection of the known negative and positive samples of raw milk showed that no false positive or false negative results appear.This method is accurate and reliable,and can be widely applied to detect β-lactam antibiotic residues.of dairy products.

dairy;β-lactam antibiotics;residues;competitive elisa

TS252.7

A

1001-2230（2010）01-0051-04

2009-08-20

浙江省質量技術監(jiān)督系統(tǒng)科研計劃項目（20080104）。

姜侃（1978-），男，工程師，研究方向為免疫學與微生物學。

張東雷