胚胎干細(xì)胞(ES)與間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)一直是組織工程最為常用的種子細(xì)胞。但目前由于ES的分離獲取存在醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的爭(zhēng)議，研究受到了一定的限制。而MSC，是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可來源于骨髓、脂肪、胎盤、臍血、臍靜脈內(nèi)皮下層、外周血及肌肉等各種組織中，在特定條件下可向骨、軟骨、心肌、脂肪、血管內(nèi)皮等間葉組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化。具有來源廣泛、相對(duì)容易獲取、擴(kuò)增表型穩(wěn)定，同時(shí)避免了醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)而越來越受到研究者們的青睞。本文就骨組織工程常用MSC的生物學(xué)特性及基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展作簡(jiǎn)要綜述。

1生物學(xué)特性分析與比較

自1995年Grane提出骨組織工程這一概念以來，經(jīng)過十幾年的研究，骨組織工程在種子細(xì)胞、支架材料以及細(xì)胞-支架材料復(fù)合體等方面的研究取得了很大進(jìn)展，為臨床骨缺損修復(fù)重建打下了良好的基礎(chǔ)。其中種子細(xì)胞的研究與應(yīng)用主要集中在以下幾種間充質(zhì)干細(xì)胞:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、肌源性干細(xì)胞等。

MSC是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可來源于骨髓、脂肪、胎盤、臍血、臍靜脈內(nèi)皮下層、外周血及肌肉等各種組織中。在特定條件下可向骨、軟骨、心肌、脂肪、血管內(nèi)皮等間葉組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化。來源不同的MSCs，雖在生物學(xué)特性方面均表現(xiàn)干細(xì)胞特性，但相互之間仍有一定差異。目前對(duì)于MSCs的生物學(xué)特性研究主要集中在以下幾個(gè)方面:

1.1分離培養(yǎng)

1.1.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs):具有來源廣泛、相對(duì)容易獲取、擴(kuò)增表型穩(wěn)定，無醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭(zhēng)議及過大的骨異常增殖趨勢(shì)等優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)為是骨組織工程最為常用的種子細(xì)胞。目前分離BMSCs的常用方法有5種:即全骨髓法、密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀法及免疫磁珠法。全骨髓法即根據(jù)干細(xì)胞貼壁特性，定期換液棄去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的;密度梯度離心法是根據(jù)BMSCs與其他細(xì)胞的密度不同而采用percoll分離液將其分離出來;貼壁篩選法則是根據(jù)BMSCs具有在塑料組織培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)的特性對(duì)其進(jìn)行分離;流式細(xì)胞儀分選法則是根據(jù)BMSC體積小、相對(duì)缺少顆粒的特性對(duì)它進(jìn)行分選;而免疫磁珠法則根據(jù)細(xì)胞表面帶有或缺失的抗原成分進(jìn)行正選或負(fù)選，用抗體包被磁珠，獲得相對(duì)純化的細(xì)胞。其中由于經(jīng)過流式或磁珠分選后的干細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)增殖緩慢等一些問題，加之耗費(fèi)較大和技術(shù)的難度，兩者應(yīng)用并不廣泛。目前最為常用分離BMSCs的方法主要是全骨髓法和密度梯度離心法，由于單獨(dú)應(yīng)用時(shí)存在獲取細(xì)胞純度不夠及數(shù)量較少等缺陷，近年有人嘗試用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，效果比較理想[1]。

BMSCs一般原代培養(yǎng)接種3～4h后開始貼壁，24h大量貼壁;2～3天見部分集落形成，大多數(shù)細(xì)胞有胞漿突起;7～10天集落迅速增多，以梭形細(xì)胞為主，胞漿豐富、核大、核染色質(zhì)細(xì)、核仁明顯，細(xì)胞呈平行排列或漩渦狀生長(zhǎng);14天左右融合達(dá)80%～90%，可進(jìn)行傳代。傳代細(xì)胞呈均勻分布生長(zhǎng)，細(xì)胞以梭形為主。BMSC的生長(zhǎng)潛伏適應(yīng)期為1～2天，3天后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6～7天后進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。BMSC倍增時(shí)間為30～50h，細(xì)胞每傳一代，細(xì)胞數(shù)約增長(zhǎng)2倍。不同物種的BMSCs特性不盡相同，不同培養(yǎng)基、血清濃度、細(xì)胞接種密度、換液時(shí)間、酶消化時(shí)間、培養(yǎng)基pH值都會(huì)影響其生長(zhǎng)[2]。

1.1.2臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs):臍帶血是臍帶內(nèi)及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，其主要包含造血干細(xì)胞(HSCs)和MSCs。與骨髓相比，臍帶血有更充足的來源;臍血的免疫原性較弱，能耐受更大程度上的HLA配型不符;移植物抗宿主病(GVHB)發(fā)生率較低;其間充質(zhì)干細(xì)胞更為原始，擴(kuò)增能力更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，故臍血干細(xì)胞可作為一種新的替代細(xì)胞來源，用于各系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植及基因治療，它的作用也越來越受到重視[3]。

目前用于UC-MSCs分離的方法同BMSCs基本相同，但UC-MSCs的分離培養(yǎng)和篩選與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、篩選過程中操作技術(shù)等多種因素有關(guān)，也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。不同培養(yǎng)基、不同批次的血清、不同的pH值、不同接植密度都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。一般原代培養(yǎng)的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞多在培養(yǎng)24～48h后貼壁，1周左右成梭形，并成克隆性生長(zhǎng)，4～5周可達(dá)80%以上的融合。原代培養(yǎng)的干細(xì)胞中可見多核，形態(tài)扁平的破骨樣細(xì)胞混雜，一般傳代至第3代時(shí)即可獲得純度較高且形態(tài)均一的長(zhǎng)梭形的間充質(zhì)干細(xì)胞[3]。

1.1.3脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs):是指從脂肪組織抽吸物中獲得的一種成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群，具有取材容易，獲得率高， 自我更新能力與多向分化潛能類似BMSCs等優(yōu)勢(shì)。原代培養(yǎng)細(xì)胞呈平行排列，漩渦樣生長(zhǎng)，細(xì)胞多為梭形、多角形等，胞漿和核仁豐富。傳代培養(yǎng)中，經(jīng)過多次傳代(10～20 代)，細(xì)胞的增殖速度無明顯減慢，衰老和死亡細(xì)胞所占比例也很少。這表明脂肪組織蘊(yùn)含豐富的干細(xì)胞，且細(xì)胞體外擴(kuò)增能力很強(qiáng)，易于傳代培養(yǎng)[4]。由于ADMSCs來源廣泛、取材容易且分離提取方法相對(duì)簡(jiǎn)單，形態(tài)及功能均類似BMSCs，近年來日益受到研究者的重視。

目前對(duì)于ADMSCs的提取主要采用的是酶消化法，即在無菌條件下取脂肪組織，經(jīng)I型膠原酶消化后離心收集沉淀再經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾獲取目的細(xì)胞。同其他MSCs一樣，不同組織來源的脂肪、不同實(shí)驗(yàn)室不同操作人員的操作技術(shù)、不同培養(yǎng)基、不同批次的血清、不同接種密度等也都會(huì)影響ADMSCs的生長(zhǎng)。

1.1.4肌源性干細(xì)胞(MDSCs):骨骼肌中含有豐富的細(xì)胞成分，從原始的干細(xì)胞到終末分化的成熟細(xì)胞。近年來在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了一群被稱為MDSCs的細(xì)胞群體。研究表明，它是和被證實(shí)的骨骼肌中含有的能夠自我更新并向肌、骨以及脂肪組織細(xì)胞等分化的肌衛(wèi)星細(xì)胞是完全不同的一類細(xì)胞群，可能是一群未向任何方向分化的原始干細(xì)胞。與BMSCs相比，其具有來源相當(dāng)豐富、易于分離、易于誘導(dǎo)成骨等優(yōu)點(diǎn)，使之得到越來越多研究者的重視，并在骨組織工程研究中被廣泛應(yīng)用。目前對(duì)于MDSCs的分離，基本上同ADMSCs，同樣是在無菌條件下取特定組織塊，然后經(jīng)酶消化后離心、過濾。具體操作流程與細(xì)節(jié)，由于實(shí)驗(yàn)室條件、操作者水平等差異，而略有差異。而純化技術(shù)主要有三種:冷凍法、Hoechst/FACS法以及Pre-plate法。其中冷凍法與Hoechst/FACS法并不常用，而Pre-plate是利用細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，經(jīng)反復(fù)貼壁培養(yǎng)而除去非干細(xì)胞以達(dá)到分離純化MDSCs的目的，因此有學(xué)者稱之為差速貼壁法。該方法在近年MDSCs的分離純化上逐漸得到認(rèn)可并被廣泛使用[5]。原代培養(yǎng)MDSCs的較其他細(xì)胞貼壁較慢，一般在分離后5～6h貼壁，其體積較小，呈球形，折光性強(qiáng)，48h后完全貼壁，并開始增生，細(xì)胞逐漸變成橢圓形或紡錘形，進(jìn)一步相互融合有規(guī)律地逐漸平行排列，7～10天時(shí)，細(xì)胞90%融合，常規(guī)消化傳代同其他干細(xì)胞[6]。

1.2細(xì)胞分化功能:MSCs是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。由于來源不同，分化表型亦有一定差異。而骨組織工程常用種子干細(xì)胞在分化功能上有著統(tǒng)一的共性—極易誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。應(yīng)用常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)劑:VitaminC、Beta-甘油磷酸鈉以及地塞米松，均可將它們成功誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。另外，隨著近年來對(duì)于細(xì)胞因子研究的深入，越來越多的細(xì)胞因子亦被發(fā)現(xiàn)具有明顯的促進(jìn)干細(xì)胞成骨的特性，如骨形態(tài)蛋白BMP、堿性成纖維細(xì)胞因子bFGF、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-Beta等[7-8]。

1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型及鑒定:目前，認(rèn)為MSCs是一個(gè)異質(zhì)細(xì)胞群， 因此至今仍未發(fā)現(xiàn)其特異性抗原表型，且不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型也有不同。BMSCs表達(dá)的抗原標(biāo)記主要有: SH2、SH3、CD29 、CD44、CD71、CD9、CD105、CDl06、CDl20a、CDl24、HLA-I等，而不表達(dá)其他造血細(xì)胞系的表面標(biāo)記CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD117 等細(xì)胞表面抗原[9-10]。這些抗原均具有間質(zhì)細(xì)胞特征，無特異性。而UCB-MSC表達(dá)的主要分子包括:①粘附分子，CD54、CD51、CD44、CD13等;②整合素家族成員，CD49b、CD49e、CD29等;③其他，CD90(Thy1)、SH2(CD105)、HLA-ABC、ASMA、SH3(CD166，ALCAM)、SH4(CD73)等。但不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD 38、CD133、CD135(Flt-3)、CD117(c-kit)、Glycophorin A等，也不表達(dá)與人白細(xì)胞抗原(HLA)識(shí)別有關(guān)的共刺激分子B7-1、B7-2及主要組織相容性復(fù)合物II類分子如HLA-DR抗原等[11]。ADMSCs在免疫表型方面則較以上兩者又有一定差異。蘇海鵬等[12]總結(jié)了體外培養(yǎng)的ADMSCs表達(dá)的蛋白:①粘附分子:可表達(dá)CD9、CD29、CD49d、CD54、CD102、CD106、CD166，但不表達(dá)CD56、CD50、CD11b、CD18、CD62;②分子受體:可表達(dá)透明質(zhì)酸鹽(CD44)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(CD71)的受體;③細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和糖蛋白:ADAS細(xì)胞能生成I和II型膠原、骨橋蛋白、ostenectin、Thy-1 (CD90) 和MUC-18 (CD146);④肌蛋白:能表達(dá)平滑肌細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白和波形蛋白;⑤造血細(xì)胞標(biāo)記:不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD14、CD31 或CD45;⑥補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白: 確定能表達(dá)衰變加速因子(CD55)和補(bǔ)體蛋白;⑦組織相容性抗原: 表達(dá)類組織相容性蛋白HLA-ABC，而不表達(dá)類蛋白HLA-DR。目前，MDSCs由于取材、分離提純方法及培養(yǎng)環(huán)境的不同，獲得的MDSCs表面標(biāo)志物也不盡相同。但Mastrogiacomo等[13]對(duì)比了MDSCs和BMSCs表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示兩者有十分相似的表達(dá)，證明兩者是性質(zhì)相似的MSCs，其特點(diǎn)為:①干細(xì)胞標(biāo)志Sca-1(+)、CD34 (+/-);②早期成肌系標(biāo)志Desmin、Bcl-2、C-met表達(dá)不一致;③造血干細(xì)胞標(biāo)志c-kit(-)、CD45(-)，其他CD10、CD13、CD56等標(biāo)志物表達(dá)不一。

2在骨組織工程中的應(yīng)用

鑒于上述間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及各自優(yōu)勢(shì)，它們?cè)诠墙M織工程研究中的應(yīng)用越來越廣泛，并在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用研究?jī)蓚€(gè)環(huán)節(jié)都取得了可喜的成果。目前，伴隨基因工程的發(fā)展，它們?cè)诠墙M織工程研究中的作用得到了更大的體現(xiàn)和發(fā)揮。

2.1 基礎(chǔ)研究:由于大塊骨缺損修復(fù)面臨的血管化難題目前還沒能得到很好解決，利用骨組織工程技術(shù)仍無法滿足臨床上形式各異的骨缺損修復(fù)需要，因而大量的基礎(chǔ)研究正在為解決血管化難題，盡快實(shí)現(xiàn)由基礎(chǔ)研究向臨床過渡而努力。Jian Zhou等[14]將兔的BMSCs與源于MSC的內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)于多孔beta-磷酸三鈣支架材料上構(gòu)建血管化組織工程骨用以修復(fù)兔的大尺寸骨缺損。結(jié)果顯示出良好的成骨和血管化效果，不僅證明該方法修復(fù)動(dòng)物大塊骨缺損行之有效，也是臨床修復(fù)大塊骨缺損很有潛力的方案。而Lei Cui等[15]利用脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合珊瑚支架，成功修復(fù)了犬臨界尺寸(20mm×20mm)顱蓋骨的缺損。實(shí)驗(yàn)在12周與24周時(shí)分別對(duì)植入犬顱蓋骨缺損處的細(xì)胞-珊瑚支架復(fù)合材料組和單純植入珊瑚材料組做三位CT及放射圖譜分析等檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組骨修復(fù)體積提高了3倍多，前者基本能夠達(dá)到良好修復(fù)顱蓋骨缺損的要求。另外，經(jīng)Rebekka等[16]研究發(fā)現(xiàn)UC-MSCs同BMSCs不僅在生物學(xué)特性方面有很多相似特性，與三維膠原支架復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫印跡分析和實(shí)時(shí)定量RT-PCR等檢測(cè)分析表明，UC-MSCs與BMSCs均展現(xiàn)了有效骨折愈合的所有特性。最后，雖然目前MDSCs在骨組織工程中的應(yīng)用不如其他細(xì)胞廣泛，但近年來呈現(xiàn)明顯增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。Kyung等[17]對(duì)大鼠MDSCs復(fù)合殼聚糖支架于體內(nèi)成骨向分化實(shí)驗(yàn)研究表明，凝膠殼聚糖支架是MDSCs粘附和增殖的理想基板，此外，細(xì)胞聯(lián)合殼聚糖支架實(shí)驗(yàn)組植入體內(nèi)后不光免疫反應(yīng)較單純植入支架組低很多以外，骨形成也被證實(shí)只存在于帶MDSCs與骨誘導(dǎo)因子的凝膠殼聚糖支架材料中。

2.2 臨床應(yīng)用:盡管目前骨組織工程技術(shù)還沒有廣泛應(yīng)用于臨床，但近年來國(guó)內(nèi)外報(bào)道的骨缺損修復(fù)臨床成功病例已越來越多。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用最早且最為常見，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞近年來也有報(bào)道，而臍血間充質(zhì)干細(xì)胞及肌源性干細(xì)胞則鮮有報(bào)道，目前還主要集中在細(xì)胞自身研究及動(dòng)物基礎(chǔ)研究階段。Marcacci等[18]將人的BMSCs復(fù)合多孔羥基磷灰石陶瓷生物材料構(gòu)建與臨床患者骨缺損尺寸大小相當(dāng)?shù)慕M織工程骨，然后利用外科手段植入臨床骨缺損處。手術(shù)早期患者無大的并發(fā)癥及其他癥狀，手術(shù)部位亦無明顯疼痛、腫脹及感染等現(xiàn)象，移植物在植入5～7個(gè)月時(shí)與宿主骨完全融合，跟蹤調(diào)查6～7年骨結(jié)合良好且未發(fā)生遲發(fā)型骨折。最終結(jié)果證實(shí)利用骨組織工程技術(shù)能夠成功修復(fù)大尺寸臨床長(zhǎng)骨骨缺損。Lendeckel等[19]則利用纖維蛋白凝膠包裹自體ADMSCs，然后應(yīng)用兩塊可吸收板將其固定于患者顱骨缺損處，術(shù)后療程順利且3個(gè)月后經(jīng)CT掃描觀察到新骨幾乎形成完整顱骨。

3 小結(jié)

間充質(zhì)干細(xì)胞以其特有的優(yōu)勢(shì)成為組織工程理想的種子細(xì)胞，并在骨組織工程基礎(chǔ)與應(yīng)用研究中被廣泛應(yīng)用。但骨組織工程要想真正實(shí)現(xiàn)血管化進(jìn)而達(dá)到臨床化，對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的研究仍有很長(zhǎng)的一段路要走。MSC來源廣泛但表型卻有很大不同，是否是同種細(xì)胞，性質(zhì)又有何特異性差別，目前尚不清楚;不同來源的MSC分化功能也有差異，如何準(zhǔn)確控制其向某一特定方向轉(zhuǎn)化也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn);另外，MSC的分離提純方法雖然很多，但同時(shí)也表明目前仍沒有一種最為理想的方法來獲取大量純化的MSC。種種問題都需要我們?cè)谘芯恐胁粩嗟厝グl(fā)現(xiàn)、分析及解決。只有這樣，MSC的價(jià)值才能在骨組織工程研究中得到最大程度的體現(xiàn)，真正造福于人類。

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[收稿日期]2010-01-03 [修回日期]2010-03-15

編輯/李陽(yáng)利