[摘要]目的:建立大鼠正畸牙移動模型，觀察PGP9.5在牙周膜(PDL)神經(jīng)中的表達及變化，探討正畸力轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元的反應(yīng)的細胞調(diào)控機制。方法:成年雄性SD大鼠25只，隨機分為5組:加力0、3、7、14、21天組，每組5只。上頜第一磨牙(URM1)施加50g近中向的拉力，按實驗期限，分別取不同組大鼠含磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊切片，進行PGP9.5免疫組化染色。鏡下觀察牙齒壓力側(cè)牙周膜神經(jīng)纖維PGP9.5免疫陽性的變化情況，并進行灰度值分析、統(tǒng)計學方差分析和t檢驗。結(jié)果:壓力側(cè)的神經(jīng)纖維的密度增加。在第7天牙槽骨表面出現(xiàn)類骨質(zhì)的沉積;第21天根吸收陷窩處可見免疫陽性的牙周神經(jīng)纖維。第3、7天牙周膜神經(jīng)纖維PGP9.5的表達最強(P<0.05)，之后神經(jīng)的表達開始下降，牙周膜神經(jīng)密度也逐漸恢復(fù)。結(jié)論:正畸加力使大鼠牙周膜神經(jīng)中PGP9.5表達增強，PGP9.5調(diào)控神經(jīng)肽的合成和分泌，可能是神經(jīng)元細胞調(diào)控的重要機制。牙周膜神經(jīng)在調(diào)節(jié)骨細胞活性和促進類骨質(zhì)的形成，以及牙根吸收和修復(fù)等過程中可能也發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]牙周膜神經(jīng);PGP9.5蛋白;正畸力;灰度值

[中圖分類號]R783.5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)04-0555-04

The expression of PGP9.5 in the periodontal tissue during experimental orthodontic tooth movement in rats

CHEN Jiang-shan，ZOU Min

(Department of Orthodontic，Stomatology Hospital of Xi`an Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression and change of PDL nerve cell mechanoreceptor，and its cell division control during the transform from orthodontic force to the reaction of nerve cells by PGP9.5 immunohistochemistry staining following the establishment of animal model.Methods25 adult male SD rats were divided into 5 groups randomly， each group had 5 rats. Putting a mesial tensile force of about 50g on URM1，the rats were forced at 0d，3d，7d，14d，21d.Tissue blot containing the molar and its surrounding alveolar bone were obtained;PGP9.5 immunohistochemistry staining was applied to measure after fixing.The change of the PDL nerve fiber PGP9.5 expression on the pressure side were observed and analyzed by gray value analysis and Statistical analysis of variance and the t test.ResultsThe density and expression of PGP 9.5 immunoreactive nerves on the pressure side increased and achieved max especially at 3d、7d(P<0.05).ConclusionThe expression of PGP9.5 obviously increased in the the process of undergoing orthodontic force. This result further indicate periodontal nerve fibers played an important role in both initial stages of bone formation and tooth root resorption， as well as in the later regenerative processes of the PDL.

Key words:PDL nerve;PGP9.5;orthodontic force;gray scale

近年來，有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)參與正畸牙移動的研究越來越受到學者們的關(guān)注。以往的研究主要是探討實驗性牙移動時神經(jīng)遞質(zhì)在牙周組織改建中的作用，但有關(guān)正畸力在神經(jīng)元中表達的信號傳導(dǎo)機制并不是很明確。本研究采用免疫組化的方法，觀察在實驗性正畸牙移動過程中牙周膜神經(jīng)末梢神經(jīng)元內(nèi)蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product9.5，PGP9.5)的表達情況，為進一步從分子水平探索正畸力轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元的反應(yīng)的細胞調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1主要試劑及儀器:PGP9.5抗體(Chemicon生物公司);SP-9001免疫組化染色試劑盒、DAB顯色盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);4%多聚甲醛固定液、10%EDTA慢脫鈣液、505E冰凍切片機(MICROM公司，德國)、Q550CW圖像信號采集與處理儀(萊卡公司，德國)、細金剛砂車針、正畸用彈力線、正畸測力計、0.25mm正畸不繡鋼結(jié)扎絲、自制手術(shù)臺、開口器、拉鉤。

1.2動物模型的建立及分組:成年健康雄性SD大鼠25只(西安交通大學動物中心提供)，體重(180±20)g，隨機分為5組:加力0(對照)、3、7、14、21天，每組5只。

本實驗采用大鼠上頜右側(cè)第一磨牙(URM1)為實驗牙。300mg/kg的計量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。麻醉后仰臥固定，用牙科高速渦輪機細金剛砂車針在上頜兩個切牙唇側(cè)及遠中和UM1近中軸角處，磨出深約0.5～1mm的固位溝。用0.25mm直徑不銹鋼正畸結(jié)扎絲將彈力線結(jié)扎在上頜切牙和UM1間，產(chǎn)生牽引UM1向近中移動約0.49N(50g)的拉力(如圖1)。嚴密監(jiān)控大鼠的矯治器，若有損壞和脫落，及時安裝。

1.3標本的制備:分別在各組時間點將大鼠處死，取出上頜骨。置10% EDTA液中4℃下脫鈣4周。將脫鈣后的上頜骨去除多余組織，保留磨牙，入30%蔗糖24h，4℃至組織沉底。沿近遠中方向縱行切片，片厚20μm，-80℃冷凍保存。

1.4免疫組織化學染色:常規(guī)SABC染色方法，切片干燥30min后，0.01mol/L PBS(PH值7.4)沖洗3次后，經(jīng)0.3%雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常羊血清封閉非特異性染色，滴加PGP9.5多克隆抗體，工作濃度1:2 000，37℃下孵育過夜，此后依次滴加生物素酶標記羊抗兔IgG第二抗體及鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)各30min，DAB液顯色。脫水，透明，封片，光鏡觀察，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5圖像分析:本實驗采用光密度分析，顯色底物為DAB，染色呈棕黃色，顏色深淺反映了DAB的沉積量，即目標抗原的量。光密度即為圖像的灰度，與染色程度成反比，即蛋白表達強則標本染色強，透光弱，灰度值低;反之，則標本染色弱，透光強，灰度值高。每組SABC染色切片各一張，使用Q550CW圖像信號采集與處理儀，對每張免疫組化染色后的切片作PGP9.5分析。測量得出平均灰度值。染色強的標本透過弱，灰度值低，陽性率高;染色弱的標本透光強，灰度值高，陽性率低。

1.6統(tǒng)計學分析

1.6.1質(zhì)量控制:為了減小測量誤差，選擇2名實驗觀察者，其學歷、資歷、技能相近，掌握圖形分析軟件的基本操作，事先未參與實驗設(shè)計。在3個月內(nèi)對受檢標本進行3次測量，所有數(shù)據(jù)進行t檢驗，無統(tǒng)計學差異。此時選用平均值納入統(tǒng)計。

1.6.2數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)±標準差表示，利用Spss13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，方差齊時，組間兩兩比較采用t檢驗;方差不齊時，兩兩比較采用t'檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1組織學觀察

2.1.1對照組(0天):根尖和根中1/3牙周膜內(nèi)可見PGP9.5免疫陽性的神經(jīng)纖維，其中一部分與牙骨質(zhì)平行。在牙周膜的根尖區(qū)域，PGP9.5免疫陽性的神經(jīng)纖維主要分布在血管周圍。少許牙周神經(jīng)纖維延伸到牙根的表面和細胞牙骨質(zhì)層(如圖2)。

2.1.2實驗組:①3天組(如圖3):與對照組相比，壓力側(cè)的神經(jīng)纖維的密度增加。其中根尖壓力側(cè)近牙槽骨區(qū)可見稠密的、串珠狀的神經(jīng)纖維的神經(jīng)纖維無規(guī)則的排列;②7天組(如圖4):與對照組相比，壓力側(cè)的神經(jīng)纖維的密度有所增加，近牙槽骨區(qū)可見沿著血管分布PGP9.5免疫陽性的神經(jīng)纖維。而靠近牙骨質(zhì)區(qū)，沒有看到分枝狀的神經(jīng)末梢。在牙槽骨表面出現(xiàn)類骨質(zhì)的沉積。但是在牙根吸收區(qū)或附近，并沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維;③14天組(如圖5):神經(jīng)密度減小，接近對照水平。根尖牙周膜的神經(jīng)主要集中在靠近牙槽骨的區(qū)域。在一些區(qū)域還是可以看到透明化的牙周組織殘留，但是牙周膜神經(jīng)纖維在這些透明區(qū)的附近很少發(fā)現(xiàn)。在牙根吸收區(qū)域內(nèi)或附近，沒有出現(xiàn)牙周膜神經(jīng)纖維;④21天組(如圖6):大鼠上頜右側(cè)第一磨牙的根吸收陷窩處可見免疫陽性的牙周神經(jīng)纖維;這些神經(jīng)纖維靠近細胞牙骨質(zhì)層。在修復(fù)牙本質(zhì)形成的區(qū)域，有免疫陽性神經(jīng)局限性的萌發(fā)反應(yīng)。透明化的區(qū)域已經(jīng)幾乎全部消失。

2.2灰度測定:正畸加力實驗組和對照組的壓力側(cè)牙周膜PGP9.5免疫陽性的神經(jīng)纖維的平均灰度值見表1。牙周膜中不同區(qū)域的神經(jīng)纖維分布不相同，因為本實驗把牙周膜三等分:根頸1/3，根中1/3，根尖1/3。

統(tǒng)計分析結(jié)果如下:①正畸加力3天組，其根尖1/3和根中1/3區(qū)域的壓力側(cè)牙周膜PGP9.5免疫陽性的神經(jīng)纖維的灰度值較對照組低，具有極顯著性差異P<0.01;②正畸加力7天組，根尖和根中1/3的平均灰度值較對照組低，具有顯著性的差異P<0.05;③正畸加力14、21天組，平均灰度值較對照組低，但沒有統(tǒng)計學意義P>0.05;④加力3、7天灰度值最低，加力時間越長，其灰度值逐漸增高。

3討論

大鼠屬嚙齒類動物，磨牙均為多根牙，結(jié)構(gòu)與特性均類似于人的牙齒，大鼠上頜磨牙有遠中方向的生理移動，以切牙的支抗拉上頜第一磨牙近中移動時需要較大的力。以往研究認為40～60g的持續(xù)力移動效果較好[1]，所以本研究選用50g的牽引力，但有根吸收出現(xiàn)，可能最恰當?shù)牧π柽M一步研究確定。

正畸力可引起牙槽骨的生理性吸收和增生，這兩個過程的發(fā)生導(dǎo)致正畸牙的移動。目前已經(jīng)被測出介導(dǎo)這種過程的生化信號包括前列腺素、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、白介素系列等。牙周膜中含有豐富的神經(jīng)末梢，在矯治力的作用下，該神經(jīng)末梢變形，向中樞或外周釋放各種神經(jīng)遞質(zhì);神經(jīng)遞質(zhì)作用于牙周膜中相應(yīng)的靶細胞，使該細胞內(nèi)的第二信使水平增加，發(fā)生新細胞的生成和增殖，導(dǎo)致牙周膜、牙槽骨等牙周組織的改建，最終牙齒移動。以往的研究主要是探討實驗性牙移動時神經(jīng)遞質(zhì)在牙周組織改建中的作用。但是正畸力在神經(jīng)元中表達的信號傳導(dǎo)機制并不是很明確。

神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)肽分泌一般機理是:在所有的真核細胞內(nèi)，最終要釋放到細胞外間隙的神經(jīng)肽在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成。新合成的蛋白首先進入細胞內(nèi)的高爾基器內(nèi)，蛋白質(zhì)在此經(jīng)歷一系列翻譯后修飾，然后轉(zhuǎn)移到囊泡內(nèi)，沿著微管被運輸?shù)捷S突終末釋放。大多數(shù)神經(jīng)活性肽開始合成的并不是其最后分泌的形式，而是首先合成一種較大的無活性的神經(jīng)肽前體蛋白。這種無活性的神經(jīng)肽前體蛋白需水解成活性鈦等小片段。泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway)是對細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進行降解的一條途徑，它所介導(dǎo)的選擇性蛋白質(zhì)降解，是細胞調(diào)控的重要機制。L'O pez-Avalos等[2]學者對編碼PGP9.5蛋白的cDNA進行測序并檢測了組織分布，認為PGP9.5是一種廣泛存在于神經(jīng)元表達于細胞內(nèi)的蛋白，是泛素C-末端水解酶(ubiquitz.in c-terminal hydrolases，UCH)的同工酶之一，可調(diào)節(jié)泛素化目標蛋白的降解速度[3]。

Vaska等[4]研究發(fā)現(xiàn)，實驗牙齒移動第3天時PGP9.5免疫陽性反應(yīng)神經(jīng)纖維表達開始增加，第7天時表達最強，2周后開始趨于恢復(fù)至正常。本實驗發(fā)現(xiàn)PGP9.5在牙齒移動過程中也呈現(xiàn)類似的時間變化規(guī)律，說明PGP9.5在牙周神經(jīng)元中的表達與正畸壓力有一定關(guān)系。正畸力的機械刺激可導(dǎo)致PGP9.5蛋白表達的增加和神經(jīng)纖維的增生。而牙周神經(jīng)PGP9.5的表達在加力3、7天陽性率最高，隨之逐漸下降，這與Vaska研究結(jié)果不盡相同，推測可能是由于所采用的大鼠品系和正畸裝置不同造成的。如由于正畸加力3～7天后上頜第一磨牙開始發(fā)生近中移動，且彈力線逐漸老化，導(dǎo)致正畸力值也相應(yīng)逐漸減少。而由于根頸1/3處牙周神經(jīng)較少，因此PGP9.5表達的改變并不明顯。

結(jié)合本研究的結(jié)果和PGP9.5的生物活性，分析正畸牙移動過程中PGP9.5在正畸牙組織改建中的作用提示我們:PGP9.5的表達與牙周神經(jīng)受到的正畸機械壓力相關(guān)。正畸加力后大鼠牙周神經(jīng)元細胞中PGP9.5表達增強，其加快神經(jīng)肽的前體蛋白水解成活性肽的速度，進而增加神經(jīng)肽的分泌。因此，在正畸牙移動過程中，泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的細胞內(nèi)神經(jīng)肽前體蛋白的降解，調(diào)控神經(jīng)肽的合成和分泌，可能是神經(jīng)元細胞調(diào)控的重要機制。

有實驗報道，成骨細胞的細胞系在體外可表達多種神經(jīng)肽的受體，這些神經(jīng)肽包括CGRP等，CGRP的成骨性刺激作用、以及它對骨吸收的抑制潛能，都通過體外和體內(nèi)試驗被證實[5]。有研究證實[6]:正畸加力可使牙周膜神經(jīng)出現(xiàn)類似損傷性改變的應(yīng)急反應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，實驗牙齒移動7天后，壓力側(cè)的神經(jīng)纖維的密度有所增加，近牙槽骨區(qū)可見沿著血管分布PGP9.5免疫陽性的神經(jīng)纖維。與此同時，在牙槽骨表面出現(xiàn)類骨質(zhì)的沉積，提示成骨活性的增加。神經(jīng)的新生與大部分的活性牙周組織重建是同時進行的。這就提示:牙周神經(jīng)纖維在正畸牙齒移動過程中，可能在調(diào)節(jié)骨細胞活性和促進類骨質(zhì)的形成中發(fā)揮一定的作用。

牙周膜神經(jīng)纖維出現(xiàn)在牙根的表面，與牙根的吸收同時發(fā)生。本實驗也出現(xiàn)了這一現(xiàn)象:第7天和14天根吸收陷窩沒有出現(xiàn)神經(jīng)纖維，但是在第21天，PGP9.5免疫陽性的神經(jīng)纖維在每個牙根的根吸收陷窩內(nèi)和附近可見。在加力21天時，根吸收陷窩內(nèi)的神經(jīng)分布與牙周組織再生的活性是同時出現(xiàn)的。有學者報道說[7]，在許多動物中機械壓力造成牙根的吸收后，類骨質(zhì)和類牙骨質(zhì)的物質(zhì)開始修復(fù)牙根吸收的部分區(qū)域。盡管他強調(diào)牙根吸收和牙根修復(fù)之間的廣泛、系統(tǒng)的相互關(guān)系，但是他也發(fā)現(xiàn)，牙周感覺和交感神經(jīng)可能也在這個過程中起到重要作用。段銀鐘等[8]等也認為外周神經(jīng)參與局部牙周改建，尤其影響骨的形成。 因此，我們推測在一定的生理條件下，牙周神經(jīng)纖維可能起到平衡硬組織形成細胞吸收和修復(fù)的作用，并因此為牙根表面提供一種保護作用。但是為了證實這種假說，我們有必要進行更多的實驗。

牙周膜神經(jīng)纖維在正畸牙移動過程中的分布變化提示我們，牙周神經(jīng)在調(diào)節(jié)骨細胞活性和促進類骨質(zhì)的形成、以及牙根吸收和修復(fù)等過程中可能也發(fā)揮重要作用。

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[收稿日期]2009-12-30 [修回日期]2010-03-08

編輯/何志斌