[摘要]目的:初步探索組織工程室在兔體內(nèi)脂肪組織工程中的應(yīng)用;建立研究兔體內(nèi)脂肪組織自發(fā)生長的動(dòng)物模型。方法:制作中空的表面帶孔的硅膠組織工程室;將兔體內(nèi)以腹壁下淺動(dòng)脈為蒂的脂肪瓣轉(zhuǎn)移至中空的硅膠組織工程室后6周取材。結(jié)果:硅膠組織工程室能很好的支持室內(nèi)脂肪瓣的生長;所有組織工程室內(nèi)內(nèi)容物體積增大，脂肪瓣外面形成一層結(jié)締組織構(gòu)成的包膜，包膜穿過組織工程室表面的孔與室外包膜交通。室內(nèi)內(nèi)容物體積從(0.5225±0.031)ml增加到(3.7625±0.106)ml，包膜體積大小為(0.7525±0.04)ml，脂肪瓣的體積從(0.5225±0.031)ml增加到(3.01±0.135)ml，增加了476%。結(jié)論:硅膠制作的組織工程室能應(yīng)用到體內(nèi)脂肪組織工程，且為室內(nèi)組織提供空間生長;成功構(gòu)建了兔體內(nèi)組織工程室內(nèi)脂肪組織自發(fā)生長的模型，帶蒂的脂肪組織可以在不添加任何細(xì)胞，生長因子的情況下自發(fā)生長。

[關(guān)鍵詞]組織工程室;脂肪瓣;脂肪組織工程;兔

[中圖分類號(hào)]R318[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)04-0518-03

Study of spontaneous adipose tissue generation of vascularized pedicled fat flap inside tissue engineering chamber

HAO Xiao-yan， YI Cheng-gang， MENG Bao-xi， LIU Bei， FU Su， XIA Wei， GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the application of tissue engineering chamber in in vivo adipose tissue engineering， to establish a model of spontaneous generation of new adipose tissue from an existing fat flap.MethodsA defined volume of fat flap based on the superficial inferior epigastric vascular pedicle was elevated and inset into a hollow silicon chamber implanted subcutaneously in the groin of the rabbit. The contents were analyzed after being in situ for 6 weeks.ResultsThe total volume of construct in all tissue engineering chambers increased significantly， from0.5225±0.031ml baseline compared to (3.7625±0.106)ml. The volume of the fat flap which included the adipocyte and blood vessels volume increased from (0.5225±0.031)mlat insertion to (3.01±0.135)ml(476% increase) in the perforated silicon chambers. Histomorphometric analysis rather than simple hypertrophy documented an increased number of adipocytes. The new tissue was highly vascularized and no fat necrosis or atypical changes were observed.ConclusionA novel method of spontaneous generation of new adipose tissue from an existing fat flap in rabbit is established. Tissue growth is spontaneous and needs no additional cells， growth or differentiation factors， or extracellular matrices.

Key words: tissue engineering chamber; fat flap; adipose tissue engineering; rabbit

體外組織工程產(chǎn)品因?yàn)闆]有自身的血管供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，大大限制了組織工程產(chǎn)品向三維立體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步發(fā)展。在目前不能構(gòu)建出組織工程血管的情況下，利用在體血管是一條可行的研究途徑。澳大利亞一研究小組把在體血管放入生物惰性材料制作的有一定硬度的組織工程室(tissue engineering chamber)，為培養(yǎng)組織提供血管基礎(chǔ)、營養(yǎng)物質(zhì)和生長所需空間[1]，這稱作血管化的組織工程室(vascularized tissue engineering chamber)?；谶@一方法進(jìn)行體內(nèi)脂肪組織工程的研究目前國外只有少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室在開展，國內(nèi)仍處于起步階段。在此實(shí)驗(yàn)中，我們擬制備能應(yīng)用到兔體內(nèi)的組織工程室，利用腹壁下淺動(dòng)脈為蒂的脂肪瓣，建立一個(gè)研究較大體積脂肪組織在體內(nèi)自發(fā)生長的動(dòng)物模型，為下一步研究和后期應(yīng)用到臨床奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要儀器:健康6月齡新西蘭大白兔8只，2.5～2.8kg， 雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。HE切片用熒光顯微鏡(Nikon)觀察并攝像。

1.2 組織工程室的制作:組織工程室由醫(yī)用硅膠制作而成，有一定的硬度，外觀呈橢圓球形，由上下兩半球體組成。半球內(nèi)徑約3.7cm，頂點(diǎn)距中心點(diǎn)約7mm。整個(gè)組織工程室內(nèi)容積10ml。組織工程室表面均勻分布直徑約3mm的孔(圖1)。組織工程室一半球側(cè)邊有約5mm的通道，為脂肪瓣血管蒂的通道。兩半球體接觸部位有約5mm的緣，方便在實(shí)驗(yàn)過程中脂肪瓣轉(zhuǎn)移到組織工程室后用縫線縫合成一室性結(jié)構(gòu)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):①對(duì)照組:切取兔一側(cè)以腹壁下淺動(dòng)脈為蒂的脂肪瓣，腹壁下淺動(dòng)脈從股動(dòng)脈發(fā)出分支到穿入脂肪時(shí)血管蒂長約2cm，脂肪瓣的大小約4cm×1cm，切去皮瓣后測量皮瓣的體積(n=8)，此對(duì)照組表示實(shí)驗(yàn)組第0天脂肪瓣的體積大小，作為實(shí)驗(yàn)組中脂肪瓣體積大小變化的參照。實(shí)驗(yàn)組所有脂肪瓣的規(guī)格都按照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(圖2);②實(shí)驗(yàn)組:按照對(duì)照組設(shè)立的標(biāo)準(zhǔn)剝離出兔另一側(cè)脂肪瓣后，把脂肪瓣轉(zhuǎn)移到帶孔的組織工程室(n=8)，并與周圍組織固定。

1.4 手術(shù)過程:所有手術(shù)均在無菌條件下進(jìn)行，3%戊巴比妥鈉1ml/kg，耳緣靜脈注射麻醉。動(dòng)物仰臥位，剃毛，消毒。在恥骨聯(lián)合上2cm做切口，切口長約5cm，按血管蒂長2cm，脂肪瓣4cm×1cm的大小剝離雙側(cè)脂肪瓣。直接切取一側(cè)脂肪瓣測量體積，把另外一側(cè)脂肪瓣通過室一側(cè)的通道轉(zhuǎn)移入帶孔的組織工程室，確定組織工程室的位置，保證血管蒂部不受牽拉，后用不可吸收線把半球底部與下面的肌肉組織縫合固定，防止脫落，兩側(cè)邊也固定在肌肉組織上，防止旋轉(zhuǎn)?？p合上下兩個(gè)半球緣部，上半球固定于表面皮膚。所有脂肪瓣中大血管結(jié)扎止血，小的電凝止血。最后用3-0的絲線縫合皮膚切口。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)手術(shù)耐受良好。

1.5 取材:6周后，再次麻醉兔子，切口方向同術(shù)前，打開雙側(cè)腹股溝區(qū)，肉眼判斷腹壁下淺動(dòng)脈是否通暢。在切取室內(nèi)內(nèi)容物的過程中明顯看到血液外流，并進(jìn)一步用鉗夾測試血流。切取組織工程室內(nèi)內(nèi)容物后測量體積，并進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。

1.6 分析方法:取材時(shí)大體觀察;對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均采用液體容積法測量體積;組織學(xué)觀察:組織塊用10%的福爾馬林固定，后用HE染色分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組脂肪瓣的體積大小采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 大體形態(tài)觀察和皮瓣體積:術(shù)后6周取材時(shí)，所有組織工程室外形成一層血管化的包膜，切開包膜后看到有淡黃色的組織液流出。觀察組織工程室室內(nèi)容物沒有明顯的炎癥和組織壞死。脂肪瓣外包繞著結(jié)締組織構(gòu)成的包膜，包膜較薄，觸之柔軟，且包膜通過室表面的孔徑與室外面的血管化的包膜交通(圖3)。包膜掀開后見脂肪瓣存活情況良好，血運(yùn)良好。所有組織工程室內(nèi)內(nèi)容物的體積均增大，體積(0.5225±0.031)ml增加到(3.7625±0.106)ml。脂肪瓣外面結(jié)締組織構(gòu)成的包膜體積(0.7525±0.04)ml，包膜占整個(gè)組織工程室內(nèi)內(nèi)容物體積的20%。去除薄膜后，脂肪瓣的體積從(0.5225±0.031)ml增加到(3.01±0.135)ml，增加了476%，與對(duì)照組相比兩者之間的體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。對(duì)照組代表脂肪瓣插入組織工程室第0天的體積大小。

2.2 組織學(xué)觀察:對(duì)照組代表脂肪瓣插入組織工程室0天的情況，HE染色顯示成熟的脂肪組織以及供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)的血管和纖維間隔。6周后組織工程室內(nèi)內(nèi)容物包括有兩種組織:結(jié)締組織組成的包膜，以及包膜包繞的脂肪瓣(圖4)。包膜主要是由纖維結(jié)締組織構(gòu)成，內(nèi)有血管分布。脂肪瓣內(nèi)脂肪組織的形態(tài)同正常的脂肪組織一樣，被血管纖維間隔分隔成若干小葉。脂肪細(xì)胞大小正常，沒有萎縮、肥大以及纖維化。在帶孔的脂肪組織工程室內(nèi)，結(jié)締組織構(gòu)成的包膜穿過孔與室外的包膜連接在一起。血管蒂和它發(fā)出的分支支持脂肪瓣的生長(圖5)。脂肪瓣的遠(yuǎn)端依然也有血管供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)(圖7)。脂肪瓣內(nèi)情況見圖8。圖4～8示6周后組織工程室內(nèi)內(nèi)容物的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。

3討論

目前用于制作體內(nèi)組織工程室的材料主要是硅膠和聚碳酸酯。早期體內(nèi)組織工程研究用到的組織工程室并非嚴(yán)格意義上的“室”，而是由雙層硅膠片重疊構(gòu)成，之后演變成圓桶裝的半封閉的室性結(jié)構(gòu)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求室內(nèi)容積大小可調(diào)整，室表面分為有孔和無孔兩種類型。組織工程室要求有一定的硬度，在體內(nèi)能為室內(nèi)內(nèi)容物提供生長的空間，同時(shí)構(gòu)建出一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境。Cronin[2]通過比較兩種材料得出:硅膠組織工程室在保持血管通暢、血管生成以及組織形成方面要優(yōu)于聚碳酸酯組織工程室。在血管模型相同，支架材料相同時(shí)，隨著時(shí)間的推移室內(nèi)組織生成的多少與組織工程室體積大小相關(guān)。表面帶孔的組織工程室能更好地促進(jìn)室內(nèi)脂肪組織的生長，而且表面帶孔的組織工程室內(nèi)內(nèi)容物表面的結(jié)締組織包膜要比薄于不帶孔的組織工程室內(nèi)內(nèi)容物。我們實(shí)驗(yàn)選用醫(yī)用硅膠材料制作的中空表面帶孔的組織工程室能滿足進(jìn)行兔體內(nèi)脂肪組織工程研究的需要。Dolderer[3]報(bào)道在表面帶孔的組織工程室內(nèi)結(jié)締組織構(gòu)成的包膜占整個(gè)內(nèi)容物的體積的53%，而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中結(jié)締組織包膜占整個(gè)內(nèi)容物體積的20%，這可能與我們的組織工程室表面的大孔徑，高孔隙率相關(guān)，加大了室內(nèi)外交通的結(jié)果。

Dolderer[3]在大鼠體內(nèi)構(gòu)建的以腹壁下淺動(dòng)脈為蒂的脂肪瓣在組織工程室內(nèi)自發(fā)生長的模型，6周后脂肪瓣在表面有孔的組織工程室內(nèi)內(nèi)容物體積可從0.08ml增加到1.2ml。因?yàn)榇笫竽Ｐ蜆?gòu)建的脂肪組織體積太小，為了日后應(yīng)用到臨床，創(chuàng)建更大的動(dòng)物模型就很必要。為此我們成功創(chuàng)建了兔體內(nèi)以腹壁下淺動(dòng)脈為蒂的脂肪瓣自發(fā)生長的動(dòng)物模型。研究結(jié)果表明把較大體積的帶血管蒂的脂肪瓣轉(zhuǎn)移到組織工程室，脂肪瓣的體積也會(huì)增加。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，組織的生長完全是自發(fā)的，不需要添加任何細(xì)胞、生長因子以及細(xì)胞外基質(zhì)。組織的生長完全依賴于其固有的血管蒂，且血管蒂能以出芽生長的方式形成更大的血管網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步支持了脂肪細(xì)胞的增殖。關(guān)于脂肪組織自發(fā)生長的機(jī)制有學(xué)者認(rèn)為是潛在的空間促進(jìn)了血管的出芽生長，血管的出芽生長進(jìn)一步支持了脂肪組織的生長。我們的研究結(jié)果也表明脂肪瓣的血管網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)展，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)脂肪瓣的遠(yuǎn)端依然有較好血循環(huán)系統(tǒng)，支持脂肪組織的生長。

乳腺癌術(shù)后再造是整形外科常規(guī)的手術(shù)之一，目前常用的方法是皮瓣轉(zhuǎn)移或脂肪移植來進(jìn)行修復(fù)[4]。皮瓣轉(zhuǎn)移包括多種島狀皮瓣和游離皮瓣，但手術(shù)塑形困難，供皮的繼發(fā)損傷較大。自體游離脂肪移植后吸收率高，且遠(yuǎn)期效果欠佳。而帶血管蒂的脂肪瓣，因?yàn)槠溆泄潭ㄑ^游離脂肪移植修復(fù)具有一定的優(yōu)勢，但缺陷是供區(qū)有限，也容易導(dǎo)致供區(qū)的繼發(fā)畸形[5]。通過本實(shí)驗(yàn)的方法，可以在體內(nèi)由小到大構(gòu)建出血管化的脂肪瓣，像皮膚擴(kuò)張器一樣先擴(kuò)張后移植，避免傳統(tǒng)的切除脂肪瓣后造成的繼發(fā)供區(qū)畸形。

這個(gè)模型也可能具有支持其他組織、細(xì)胞生長的潛能，因?yàn)橐呀?jīng)存在的帶蒂的脂肪瓣可以提供血管化的基礎(chǔ)以及內(nèi)源性的生長因子。此外組織工程室的應(yīng)用，不僅為室內(nèi)組織提供了生長所需的空間，而且構(gòu)建出的相對(duì)獨(dú)立的空間便于實(shí)驗(yàn)的干預(yù)，局部應(yīng)用一些生長因子或者誘導(dǎo)因子，加速室內(nèi)組織的生長，又不影響全身的組織，這可能是未來利用組織工程室進(jìn)行體內(nèi)組織工程研究的重點(diǎn)。

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[4]齊彥文，李建寧，李比.乳腺癌術(shù)后即刻乳房重建的適應(yīng)證及手術(shù)方法的選擇[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2009，18(4):568-571.

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[收稿日期]2009-11-26 [修回日期]2010-02-23

編輯/張惠娟