摘 要:鱗莖的皮色是洋蔥的重要經(jīng)濟性狀之一。洋蔥的二氫黃酮醇-4-還原酶基因AcDFR1的開放閱讀框為1 158 bp，編碼385個氨基酸殘基;具有5個內(nèi)含子，均符合GT-AG規(guī)則。本研究為闡明洋蔥皮色形成的分子機制以及開發(fā)

分子標記奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:二氫黃酮醇-4-還原酶基因;基因克隆;序列分析;洋蔥

中圖分類號:S633.22∶Q785 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)02-0008-05

百合科蔥屬蔬菜是類黃酮含量較高的蔬菜種類之一。類黃酮是一類供氫型自由基清除劑，具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值，對人體健康有重要影響。在防治心腦血管疾病、保肝護肝、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗雌激素缺乏、抗消化性潰瘍、抗過敏、消炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、止咳、平喘等方面有重要作用[1，2]。

洋蔥(Allium cepa L.)是百合科蔥屬二年生草本植物，是世界上重要的蔬菜作物。洋蔥不僅可以鮮食，還是很好的加工原料，已成為我國主要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一。洋蔥以肥大的肉質(zhì)鱗莖為食用器官，根據(jù)其鱗莖的皮色可分為紅皮、黃皮和白皮等品種。皮色是洋蔥的重要經(jīng)濟性狀之一，其遺傳規(guī)律已經(jīng)被揭示[3，4];但其分子機制仍不十分清楚，相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因有待進一步的克隆和研究。

花青素的生物合成前體為丙二酰CoA 和對香豆酰CoA，由苯基乙烯酮合成酶(CHS)催化二者形成苯基乙烯酮。黃色苯基乙烯酮異構(gòu)化形成無色的黃烷酮。在黃烷酮羥基化酶(F3H)催化下形成無色的二羥基黃酮醇，由二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)催化還原形成無色花色素，無色花色素在花青素合酶作用下轉(zhuǎn)變成有色花色素。然后由UF3GT (UDP- 葡萄糖類黃酮-3- 氧- 葡萄糖轉(zhuǎn)移酶)催化，糖基化形成花青素[5，6]。從二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變成花青苷的反應(yīng)非常復雜， DFR 是這一轉(zhuǎn)變中起作用的第一個酶，失去DFR 活性的突變體產(chǎn)生象牙色或者白色。由于不同物種的DFR對底物的選擇性不同，所以合成不同的花色素，呈現(xiàn)各異的顏色。DFR基因是Reilly 等采用轉(zhuǎn)座子標簽法首先從玉米和金魚草中分離出來的[7]。后來從許多其它物種(如擬南芥、小麥、金蕎麥和甘薯等)中相繼克隆出來[8～11]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以洋蔥的新鮮葉片和花為材料，采自山東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA、RNA提取

基因組總DNA用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，用pH 8.0 的TE 稀釋成50 ng/μl?？俁NA用RNAsimple總RNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，cDNA 第一鏈的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen，北京)完成。

1.3 PCR反應(yīng)

本研究所用的上游引物P1: CAACGCCAACTTAGAAGAAAGAAC和下游引物P2: GACACAGGGAATAGGGAAATTGG由博尚生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為25 μl，其中模板(基因組總DNA或者cDNA)1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，引物各0.5 μl，10×Ex-Taq buffer 2.5 μl，Ex-Taq DNA polymerase(Takara，大連)0.13μl，用滅菌蒸餾水補充至25 μl。

擴增程序:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，57℃退火 1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán);最后72℃保溫8 min。

1.4 目的片段的克隆

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Fluor Chem TM 5500凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech， USA)上檢測并照相記錄，分子量Marker DL2000從大到小依次為:2000、1000、750、500、250和100 bp。

PCR 擴增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(Tiangen，北京)進行回收，與克隆載體pMD18-T(Takara，大連)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆送到博尚生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5 序列分析

序列比對通過Blast(http://www.ncbi.

nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進行。生物信息學分析主要采用DNAMAN 軟件及http://www.expasy.org 、http://www.softberry.com等鏈接的網(wǎng)上軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥AcDFR1基因的克隆

洋蔥總DNA擴增的PCR 產(chǎn)物和RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分離(圖1)。再通過回收、連接、轉(zhuǎn)化后，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆進行序列測定。測序結(jié)果顯示總DNA擴增片段1 709 bp，RT-PCR 產(chǎn)物11 289 bp，將其序列進行ORF分析，發(fā)現(xiàn)有完整的開放讀碼框。其ORF序列1 158 bp，預測的蛋白質(zhì)由385個氨基酸殘基組成，將其命名為AcDFR1基因。

2.2 洋蔥AcDFR1基因的序列特征

將AcDFR1基因的基因組序列和cDNA序列進行比對，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)有6個外顯子和5個內(nèi)含子(圖2)。這些內(nèi)含子都符合GT-AG規(guī)則，即其5′端為GT核苷酸殘基、3′端為AG核苷酸殘基。

擬南芥的DFR基因也有6個外顯子和5個內(nèi)含子，將二者相對應(yīng)的外顯子和內(nèi)含子分別做序列比對，結(jié)果(圖3)顯示的序列相似性:外顯子依次為48.53%、62.35%、69.74%、68.75%、61.86%和42.63%;內(nèi)含子依次為40.86%、33.64%、42.31%、44.44%和41.49%?？梢姡怙@子的相似性明顯高于內(nèi)含子，說明內(nèi)含子序列為非編碼區(qū)，受自然選擇的壓力小，變異較大、較快。

2.3 洋蔥AcDFR1基因編碼蛋白的特征

將洋蔥AcDFR1基因預測的編碼蛋白與模式植物水稻和擬南芥的DFR蛋白進行序列相似性比較，結(jié)果(圖4)顯示它們的部分區(qū)域很保守，這些區(qū)域可能與它們的功能發(fā)揮有重要作用。其N端存在一個NADP 結(jié)合位點VTGAS(G)GF(Y)VGSWLVMK(R)LLHYGY，而C端的差異較大。

用Signal P 3.0 Server 檢測，結(jié)果顯示AcDFR1不含信號肽序列，為非分泌蛋白。采用SOPMA 進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果表明AcDFR1 蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(Alpha helix，39.74%)、少量的延伸鏈(extend strand，16.36%)、β-轉(zhuǎn)角(Beta turn，6.75%)和隨機卷曲(Random coil，37.14%)組成。

2.4 DFR編碼蛋白的進化樹分析

將洋蔥的DFR基因與水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、鹿子百合(Lilium speciosum)、郁金香(Tulipa gesneriana)、早花百子蓮(Agapanthus praecox)、荷蘭鳶尾(Iris hollandica)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、圓葉牽牛(Ipomoea purpurea)、裂葉牽牛(Ipomoea nil)、甘薯(Ipomoea batatas)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、煙草(Nicotiana tabacum)等的二氫黃酮醇-4-還原酶進行聚類分析。結(jié)果(圖5)單子葉植物和雙子葉植物各聚成一個大類。洋蔥與早花百子蓮、鹿子百合、郁金香等其它百合科植物聚成一類;同時與禾本科的水稻、小麥、大麥、玉米和高粱聚成一大類。這就提示我們，在今后的洋蔥研究工作中，可以借鑒其它單子葉植物的相關(guān)信息，同時參考雙子葉模式植物。

3 討論與結(jié)論

核酸序列和蛋白質(zhì)序列的分析結(jié)果表明，我們已從洋蔥中成功克隆了AcDFR1基因的全長gDNA和cDNA序列。其ORF序列1 158 bp，預測的蛋白質(zhì)由385個氨基酸殘基組成。將AcDFR1基因的基因組序列和cDNA序列進行比對，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)有6個外顯子和5個內(nèi)含子。根據(jù)GenBank上登錄的資料，擬南芥、金魚草與矮牽牛的DFR基因序列也都包含6 個外顯子，5 個內(nèi)含子;這些內(nèi)含子剪切位點都符合真核生物典型的GT-AG 規(guī)則。

DFR基因是控制花色素苷和原花色素生物合成分支途徑的關(guān)鍵酶基因，其分子特征和調(diào)控已在很多植物中得到深入研究。擬南芥中位于tt3 位點的DFR結(jié)構(gòu)基因突變，使得種子表皮中缺乏花色素的積累，導致tt(transparent testa，透明的種皮)表現(xiàn)型[8]。矮牽牛細胞中由于缺少將二氫三羥黃酮醇轉(zhuǎn)化為無色天竺葵青素苷的DFR酶，缺少天竺葵青素苷，從而導致矮牽牛中缺少橘紅、磚紅和亮紅色的品種。Meyer等[12]將玉米的DFR基因轉(zhuǎn)入矮牽牛變異株RL01株系(花呈白色)，獲得的轉(zhuǎn)基因株開出的花呈紅色。Petit等[13]首次對DFR的三維結(jié)構(gòu)進行了詳細描述，進一步證實了其NADP結(jié)構(gòu)域和底物特異結(jié)合位點的存在。

此次試驗成功克隆了洋蔥的DFR基因，為洋蔥花青素合成代謝及調(diào)控途徑的研究奠定了基礎(chǔ)。隨著洋蔥類黃酮生物合成途徑的相關(guān)基因逐步被揭示，我們將從這些基因的內(nèi)含子和啟動子序列的多態(tài)性中開發(fā)皮色相關(guān)的分子標記，并把這些標記應(yīng)用于洋蔥的雜交育種實踐中，建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的洋蔥雜交育種體系。

參 考 文 獻:

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