摘 要:試驗(yàn)設(shè)侵染時間、菌液濃度和侵染溫度3個因素， 利用根癌農(nóng)桿菌將LeJA2基因按L₉(3₄) 正交表轉(zhuǎn)化番茄。結(jié)果表明，當(dāng)菌液濃度為OD₂₆₀=0.6、侵染溫度40℃、侵染10 min時的轉(zhuǎn)化效果較好，從而建立了較優(yōu)的LeJA2基因沉默表達(dá)載體導(dǎo)入番茄的轉(zhuǎn)化體系，并已得到14株轉(zhuǎn)化再生的番茄植株， 經(jīng)卡那抗性篩選和PCR檢測，證明LeJA2-RNAi基因已導(dǎo)入番茄并表達(dá)。

關(guān)鍵詞:LeJA2基因;根癌農(nóng)桿菌;番茄;轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

中圖分類號:Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2010)02-0016-04

目前，各類昆蟲的侵害對農(nóng)作物生產(chǎn)構(gòu)成了極大威脅，而化學(xué)殺蟲劑的使用對環(huán)境和人類健康都會產(chǎn)生極大的危害。因此明確植物自身的抗性反應(yīng)機(jī)制，從而降低化學(xué)藥劑的使用量，成為目前的迫切需求和研究熱點(diǎn)。2003年，李傳友等[1]發(fā)現(xiàn)作物系統(tǒng)抗性中可以進(jìn)行長距離運(yùn)輸?shù)氖擒岳蛩岫皇窍到y(tǒng)素，因此茉莉酸介導(dǎo)的抗性反應(yīng)途徑成為目前的研究熱點(diǎn)。LeJA2基因是番茄抗性反應(yīng)途徑重要的上游調(diào)控基因，研究和明確該基因的功能對于研究茉莉酸抗性反應(yīng)途徑具有重要的意義。本研究利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將反義LeJA2基因?qū)敕眩?并試圖找到影響轉(zhuǎn)化頻率的主要因素， 建立起高效穩(wěn)定的番茄轉(zhuǎn)化體系，為下一步進(jìn)行更深入的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株及基因 根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404; LeJA2-RNAi基因，長度517 bp，位于載體pUCCERNAi上。

1.1.2 植物材料 番茄常規(guī)品種M82，由中國科學(xué)院番茄資源研究中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子生長培養(yǎng)基:1/2 MS;預(yù)(共)培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+1.0 mg/L ZT;篩選分化培養(yǎng)基:MS+2.0 mg/L ZT+500 mg/L Amp+100 mg/L Kana;生根培養(yǎng)基:MS+50 mg/L Amp+50 mg/L Kana+1 mg/L IBA。 上述培養(yǎng)基若加抗生素，均需將無菌的培養(yǎng)基置于超凈工作臺上， 待培養(yǎng)基冷卻至60℃后，再將無菌的抗生素加入。

1.2 質(zhì)粒檢測方法

采用堿解法提取質(zhì)粒，于含EB (溴化乙啶)的1.2% 瓊脂糖上100 V 電泳45 min，紫外燈下觀察，結(jié)果見圖1。

1.3 植物材料的準(zhǔn)備取番茄常規(guī)品種M82， 挑選飽滿、粒大種子，用70% 酒精消毒2 min，無菌水沖洗3 遍;然后用10%NaClO浸泡15～20 min，再用無菌水沖洗3 遍， 接種于1/2 MS基本培養(yǎng)基上，于25℃光照培養(yǎng)。7～ 8 d 萌發(fā)后， 在無菌條件下切成子葉塊， 預(yù)培養(yǎng)1～2 d 后，即可用于轉(zhuǎn)化。

1.4 根癌農(nóng)桿菌菌株及培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌液的制備:挑取一個單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基(附加50 mg/L Kana)中并于(27±1)℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)。菌液以5 000 r/min離心10 min，棄上清，并用液體MS培養(yǎng)基重新稀釋懸浮后，以備轉(zhuǎn)化之用。菌液濃度以肉眼鑒別渾濁，對著光不透明為好(OD260=0.6)。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)設(shè)侵染溫度、侵染時間和菌液濃度3因素，因素及水平見表1，采用L9(34)正交設(shè)計。

1.6 外植體的轉(zhuǎn)化采用“葉盤法”[2～ 4]。切取無菌苗的子葉獲得無菌苗塊，在MS附加1.0 mg/L玉米素的D1培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1 d，按正交表所提供的處理進(jìn)行侵染，即分別浸入制備好的農(nóng)桿菌菌液和液體MS

中，以浸入MS 中的子葉塊作為陰性對照。侵染結(jié)束后取出，用無菌濾紙吸干，然后接種于無抗生素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基上放濾紙)，在(27±1) ℃、有一定散射光的條件下共培養(yǎng)2 d 后，取出轉(zhuǎn)化塊和對照塊，用100 mg/ L Amp液漂洗10 min，進(jìn)一步除去農(nóng)桿菌污染，以無菌濾紙吸干子葉塊表面的液體，轉(zhuǎn)入 MS+2.0 mg/L ZT+500 mg/L Amp+100 mg/L Kana的2Z培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選(無濾紙)。轉(zhuǎn)入到抗性篩選培養(yǎng)基中的外植體，每2～3周繼代一次。2～3周后，對照葉片全部變黃或褐化死亡，轉(zhuǎn)化塊的許多外植體開始長出綠色或者白色的愈傷，也有部分外植體變褐或死亡。培養(yǎng)5～8周后產(chǎn)生抗性芽。當(dāng)不定芽伸長至2～3 cm 時，用解剖刀將抗性芽切下，并轉(zhuǎn)接至MS +1 mg/L IBA+50 mg/L Kana+50 mg/L Amp的生根培養(yǎng)基上。

1.7 PCR 檢測

1.7.1 番茄總DNA 提取 取4～5葉齡的轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的葉片， 按SDS 法提取總DNA。

1.7.2 引物設(shè)計 按照目的基因兩端序列，設(shè)計約20個堿基的2個引物:

LeJA2-RNAi-F(BamHⅠ):5'-GGATCCAAGACGAATTGGATTA-3';

LeJA2-RNAi-R(XbaⅠ) :5'-TCGTCTAGATTAATACTTTCAACC-3'

1.7.3 PCR 擴(kuò)增 95℃變性5 min 后，加入2 U/μlTaq 酶1 μl，然后94℃ 50 s， 55℃ 90 s， 72℃ 2 min，35個循環(huán);反應(yīng)結(jié)束后，在含EB 的1%瓊脂糖凝膠上100 V 電泳30 min，紫外燈下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化頻率的方差分析

由表2可以看出，菌液濃度的R值最大，說明菌液濃度對抗性愈傷的出愈率影響最大;其次為侵染溫度和侵染時間。三者的最好組合為侵染濃度OD260=1.2，侵染溫度40℃，侵染時間10 min，此時轉(zhuǎn)化率最高，為15.13%。但實(shí)際試驗(yàn)過程中，當(dāng)選取農(nóng)桿菌的侵染濃度為OD260=1.2時，羧芐霉素不能很好地抑制農(nóng)桿菌的繁殖增生，外植體的邊緣受到農(nóng)桿菌的毒害而發(fā)黑，從而死亡，這就大大降低了抗性愈傷的形成率和外植體的生長性，所以最終選擇菌液濃度為OD260=0.6。因此，如果要建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，就必須慎重選擇菌液的侵染濃度，同時選擇最適侵染時間和侵染溫度，以期獲得大量的轉(zhuǎn)基因植株。

2.2 PCR 檢測結(jié)果

選取30棵抗性苗進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果從14棵抗性苗中擴(kuò)增出517 bp的目的帶，而未轉(zhuǎn)化的番茄植株沒有擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶(圖2)。轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)了一些假陽性植株，可能是由于番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系建立過程中，沒有保證子葉外植體與培養(yǎng)基平整接觸，導(dǎo)致其因快速生長而出現(xiàn)上翹和卷曲，使農(nóng)桿菌的接種面離開培養(yǎng)基，從而使一些非轉(zhuǎn)化細(xì)胞逃脫抗性篩選產(chǎn)生假陽性植株。

3 討論與結(jié)論

3.1 從原理上說，菌液濃度越大，侵染外植體的機(jī)率越大，轉(zhuǎn)化率越高;但當(dāng)濃度過高，易造成污染，且很難除菌， 影響外植體的分化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然正交試驗(yàn)顯示菌液濃度為OD260=1.2時，轉(zhuǎn)化效率最高，但實(shí)際培養(yǎng)過程中，在此濃度時農(nóng)桿菌大量繁殖，污染嚴(yán)重，許多外植體的邊緣發(fā)黑甚至死亡，所以最終選取菌液濃度為OD260=0.6。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，子葉外植體在菌液中浸泡的時間不能過長，一般10 min 左右即可，以防止培養(yǎng)過程中出現(xiàn)子葉外植體褐化或農(nóng)桿菌過度生長，抑制分化成苗。所以最后選取的較優(yōu)組合為菌液濃度OD260=0.6，侵染時間10 min，侵染溫度40℃。

3.2 在轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)過程中，還會出現(xiàn)少數(shù)畸形化芽或玻璃化苗，主要表現(xiàn)為畸形化芽的葉片大、厚，無生長點(diǎn);玻璃化植株葉片、莖呈半透明玻璃質(zhì)，脆弱易碎，并且生根比較困難。這對提高轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定性都會造成一定影響 。

3.3 本試驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過嚴(yán)格地 Kana 抗性篩選，淘汰了大量非轉(zhuǎn)化植株，并且成功地獲得了再生轉(zhuǎn)化植株，初步建立了番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系。對轉(zhuǎn)化植株的 PCR檢測證明，LeJA2-RNAi基因已整合到番茄基因組中。

參 考 文 獻(xiàn):

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