摘 要:對(duì)不同銅、鋅處理下凱特杏體內(nèi)的丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明:銅離子不利于凱特杏細(xì)胞膜的穩(wěn)定，而鋅離子有利于凱特杏細(xì)胞膜的穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞:銅;鋅;凱特杏;抗氧化酶活性;膜脂過(guò)氧化

中圖分類號(hào):S662.201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2010)02-0043-04

活性氧自由基與細(xì)胞衰老死亡關(guān)系的研究正在日益深入。業(yè)已知道，在細(xì)胞衰老死亡過(guò)程中，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量帶有奇數(shù)電子，即帶有未配對(duì)自由電子的化學(xué)物質(zhì)——自由基，它們具有高反應(yīng)活性，不僅其本身可以損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且還能與細(xì)胞中產(chǎn)生的H2O2等反應(yīng)生成其它自由基。類脂是膜結(jié)構(gòu)的主要組成部分，通常是由不飽和脂肪酸組成的，膜脂過(guò)氧化作用就是在氧自由基的誘導(dǎo)下發(fā)生在生物膜不飽和脂肪酸中的一系列自由基反應(yīng)。脂質(zhì)過(guò)氧化形成的脂氫過(guò)氧化物(LOOH)不穩(wěn)定，并能自發(fā)地發(fā)生均裂形成脂性自由基(LOO#8226;，LO#8226;)。它們非?；顫姡环矫孢B鎖地引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，另一方面又能引發(fā)蛋白質(zhì)分子脫H+而生成蛋白質(zhì)自由基(P#8226;)，蛋白質(zhì)自由基與另一分子蛋白質(zhì)發(fā)生加成反應(yīng)，生成二聚蛋白質(zhì)自由基，依次對(duì)蛋白質(zhì)不斷加成(鏈?zhǔn)骄酆献饔?而生成蛋白質(zhì)分子聚合物。同時(shí)LOOH亦可分解產(chǎn)生丙二醛，它可與蛋白質(zhì)分子交聯(lián)形成交聯(lián)物，使膜系統(tǒng)發(fā)生變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。

SOD、POD、CAT等是能清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基O-2#8226;)、羥基自由基(#8226;OH )和H2O2等有害物質(zhì)的抗氧化酶類，均含有不同的金屬輔基，他們與酶的結(jié)構(gòu)及活性有著直接的關(guān)系，當(dāng)用透析等方法制備成脫輔酶后，酶的活性幾乎全部喪失。在酶的制備和測(cè)活過(guò)程中，人為補(bǔ)加與輔基相同或不同的離子后，酶的功能和活性均會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。本文研究了不同處理銅離子和鋅離子對(duì)凱特杏體內(nèi)SOD和POD活性的影響，這對(duì)揭示抗氧化酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為果實(shí)保鮮提供了科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以凱特杏為試材，均選果形端正、果實(shí)充分發(fā)育、果肉有一定硬度、八成熟的無(wú)機(jī)械傷、無(wú)蟲(chóng)害的一級(jí)果采摘。

將采摘的凱特杏置于不同處理溶液中浸泡15 min后取出，一部分于常溫下放置一周，用于測(cè)定MDA含量;另一部分于不同溫度下處理2 h后測(cè)定SOD和POD活性，溫度處理從10℃開(kāi)始，每增加5℃測(cè)定一次，到60℃為止。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 SOD活性測(cè)定 參考王金勝的方法。分別稱取凱特杏果肉樣品0.5000 g于研缽中，加入50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0) 3 ml，冰浴研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，于13 000×g冷凍離心10 min，取上清，即為酶提取液。取3支試管，分別編號(hào)1、2、3，加入3.9 ml NBT反應(yīng)介質(zhì)[用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)配制而成，內(nèi)含77.12 μmol/L NBT，0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，13.37 mol/L 蛋氨酸];1、2號(hào)試管再加入0.01 ml酶液，混合均勻，3號(hào)試管不加酶液用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0) 0.01 ml代替;最后向各試管中加入80.2 μmol/L核黃素溶液0.1 ml搖勻，將2號(hào)試管用黑紙包上，與其它試管一起放于4 000 lx的熒光燈下光照25 min，取出，以2號(hào)試管為空白，測(cè)定560 nm處的吸光值。SOD 活性依下式計(jì)算:

SOD活性(U/gFW)=ΔA×N/(A0×W×0.01×50%)

其中，A0為3號(hào)試管溶液在560 nm處吸光值;ΔA為3號(hào)試管溶液與加酶液管的反應(yīng)液在560 nm處吸光值的差;N為酶液總體積;W為提取酶液材料鮮重;0.01為反應(yīng)體系中加入的酶液體積;50%表示以抑制NBT光化還原反應(yīng)的50%為一個(gè)酶活力單位。

1.3.2 POD活性的測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚法。分別稱取各待測(cè)凱特杏果肉樣品0.5000 g，加入PVP 0.25 g及少量石英砂和0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0) 5 ml，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，于10 000×g冷凍離心10 min，取上清，即為酶提取液。取10 ml試管，加入0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0) 2.9 ml +0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1 ml +酶液1 ml，立即置于30℃水浴保溫3 min，然后加入2% H2O2 1 ml繼續(xù)保溫1 min，取出立即測(cè)定470 nm處吸光度值，每隔60 s讀數(shù)一次，共讀五次。以每克鮮重材料每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，其計(jì)算公式如下:

POD活性(U/gFW)=ΔA×D/(0.01×W×t)

其中，ΔA 為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度變化值;W為鮮樣品質(zhì)量(g);t為反應(yīng)時(shí)間(min);D為酶液稀釋倍數(shù)。

1.3.3 MDA含量的測(cè)定 按硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定。分別稱取各待測(cè)凱特杏果肉樣品0.3000 g于研缽中，加適量石英砂及蒸餾水2 ml研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入試管內(nèi)，再用蒸餾水2 ml和1 ml沖洗研缽兩次，一并轉(zhuǎn)入試管內(nèi);沿試管壁加入用5%三氯乙酸配制的0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液5 ml，搖勻，沸水浴10 min(從試管內(nèi)冒氣泡開(kāi)始記時(shí))。取出，冰浴，搖勻，轉(zhuǎn)入離心管中，于3 000×g離心15 min后取出，記錄上清液體積，于532 nm和600 nm波長(zhǎng)下比色。依下式計(jì)算MDA含量:

MDA含量(mmol/gFW)=ΔA×N/(155×W)

式中，ΔA為A532與A600的差;N為上清液的總體積;155為1 mmol三甲川在532 nm的吸光值;W為稱取的植物材料的鮮重(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同銅、鋅處理對(duì)凱特杏中MDA含量的影響

MDA是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量的多少可以代表膜脂過(guò)氧化水平和生物膜損傷程度的大小。試驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明，處理4(Cu0Zn1)的凱特杏MDA含量較其它處理顯著降低，表明鋅有助于膜的穩(wěn)定，主要原因可能與鋅能明顯提高各保護(hù)酶的活性，從而削弱了活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害有關(guān)。而處理3(Cu1Zn0)的凱特杏MDA含量明顯高于對(duì)照，說(shuō)明銅不利于膜的穩(wěn)定。雖然銅離子也是SOD的組成離子，在提高SOD的活性上起積極作用，但與此濃度銅離子帶來(lái)的傷害相比作用甚微，因此表現(xiàn)出MDA含量的明顯提高。處理2(Cu1Zn1)的凱特杏MDA含量與對(duì)照差異不明顯，表現(xiàn)出鋅離子和銅離子共同作用的結(jié)果，即銅離子對(duì)凱特杏的傷害與銅、鋅離子對(duì)SOD活性提高兩方面共同作用的結(jié)果。

2.2 不同銅、鋅處理及不同溫度對(duì)凱特杏SOD活性的影響

由圖2可以看出，凱特杏的SOD活性隨處理溫度的升高呈“S”形變化，低于25℃時(shí)，隨溫度升高，SOD活性逐漸降低;達(dá)到25℃后，隨溫度升高SOD活性逐漸升高;超過(guò)45℃后，SOD活性又快速下降。表明，室溫(25℃)時(shí)凱特杏的生理活性比較穩(wěn)定，活性氧的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡之中;低于25℃或高于25℃時(shí)，受低溫或高溫脅迫的誘導(dǎo)，凱特杏自發(fā)地提高體內(nèi)SOD的活性，以消除脅迫產(chǎn)生的大量活性氧自由基，降低活性氧對(duì)機(jī)體造成的傷害;但當(dāng)溫度超過(guò)45℃時(shí)，酶開(kāi)始受熱變性，導(dǎo)致SOD活性大幅降低，機(jī)體受到嚴(yán)重傷害。

不同溫度條件下，各銅、鋅處理均能提高SOD活性，可平均提高4.7個(gè)酶活力單位，而且變化趨勢(shì)相似，其中，處理4(Cu0Zn1)的效果最明顯。表明，鋅離子和銅離子處理均可提高凱特杏的SOD活性，但鋅離子更有利于SOD活性的提高，可在一定程度上保護(hù)細(xì)胞免受活性氧自由基的傷害。

2.3 不同銅、鋅處理及不同溫度對(duì)凱特杏POD活性的影響

結(jié)果(圖3)表明，凱特杏中POD活性隨溫度的變化趨勢(shì)與SOD活性的變化趨勢(shì)相似，只是處理3在25~35℃之間有次小的波動(dòng)。說(shuō)明10~50℃時(shí)，凱特杏自身產(chǎn)生的活性氧及由超氧陰離子通過(guò)SOD轉(zhuǎn)化而成的H2O2較少，均可通過(guò)提高POD活性進(jìn)行消除，從而基本維持體內(nèi)活性氧的代謝平衡，保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行;但當(dāng)溫度超過(guò)50℃后，因受熱變性及大量活性氧產(chǎn)生所造成的不可逆?zhèn)?，POD活性快速下降。而不同銅、鋅處理均可提高凱特杏體內(nèi)的POD活性，其中處理4(Cu0Zn1)的POD活性明顯高于其它處理，表明鋅離子更有利于POD活性的提高。

3 結(jié)論與討論

3.1 銅離子和鋅離子對(duì)SOD活性的影響

SOD是已知穩(wěn)定性較高的球蛋白之一，是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要抗氧化酶。根據(jù)所含輔基的不同，一般可將SOD分為Cu#8226;Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種類型，而鋅離子是Cu#8226;Zn-SOD的活性中心，因此，當(dāng)同一體系中鋅離子濃度較低而銅離子濃度較高時(shí)，銅離子對(duì)SOD結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)力增大，導(dǎo)致SOD中的鋅離子被銅取代形成Cu#8226;Cu-SOD或天然的Cu#8226;Zn-SOD構(gòu)象發(fā)生變化，從而降低其活性[1]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，鋅離子更有利于凱特杏SOD活性的提高，更有利于其貯藏保鮮。

3.2 銅離子和鋅離子對(duì)凱特杏POD活性的影響

POD能催化過(guò)氧化物和H2O2與多種有機(jī)、無(wú)機(jī)氫供體發(fā)生氧化-還原反應(yīng)。POD在植物體內(nèi)主要有兩方面作用:一方面與植物正常的形態(tài)發(fā)生和形態(tài)建成有關(guān)，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中起作用;另一方面與植物的抗逆性有關(guān)，包括抗旱、抗寒、抗鹽、抗病等，是植物保護(hù)酶系的重要保護(hù)酶之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)用鋅離子處理，能很好地提高植物體內(nèi)的POD活性，單獨(dú)用銅離子處理對(duì)POD活性的影響次之，兩者均高于銅離子和鋅離子共同處理的POD活性，原因有待進(jìn)一步研究。

3.3 銅離子和鋅離子對(duì)凱特杏質(zhì)膜透性的影響

MDA是細(xì)胞原生質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，其含量可反映膜脂過(guò)氧化作用的強(qiáng)弱[2]。本試驗(yàn)結(jié)果表明:鋅離子更有利于提高凱特杏體內(nèi)抗氧化酶的活性，降低膜脂過(guò)氧化作用，從而更好地保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。原因可能是作為抗氧化酶SOD的組成成分，鋅的加入增加了有效SOD的合成量，從而間接地消除或減輕了自由基造成的傷害。同時(shí)，鋅可與硫蛋白結(jié)合成金屬硫蛋白，而金屬硫蛋白有明顯自由基消除及細(xì)胞保護(hù)的作用。銅離子對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)性較差，原因可能是銅離子在體內(nèi)主要是作為酶的輔基或蛋白質(zhì)的配位成分參與機(jī)體的代謝活動(dòng)，正常情況下多為蛋白質(zhì)螯合，游離的形式很少，但當(dāng)機(jī)體代謝發(fā)生紊亂或處于病理?xiàng)l件下時(shí)，銅離子就會(huì)游離出來(lái)，不僅可造成某些修復(fù)酶失活，還可誘發(fā)多種活性中間物及自由基的產(chǎn)生，特別是活性氧和活性氮中間物，后者可導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸等大分子的損傷，破壞正常的代謝調(diào)控或引起遺傳物質(zhì)的變化，這種損傷的積累就是造成衰老和多種疾病的原因。銅離子還易形成配合物，這不僅增加了其在植物體內(nèi)的含量，還能使其氧化還原電位發(fā)生變化，形成Cu+，而Cu+能以抗壞血酸做還原劑催化自由基的形成[3]。這導(dǎo)致銅離子可以經(jīng)過(guò)多次再還原和再氧化過(guò)程，催化產(chǎn)生更多的羥基自由基。另外，銅離子可顯著提高PPO活性。PPO可將酚類物質(zhì)氧化成毒性很強(qiáng)的醌，醌類物質(zhì)可與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵，對(duì)緩解外界病蟲(chóng)害有一定作用，但本身會(huì)使植物體產(chǎn)生毒性氧，使植物受到傷害。

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