摘 要:以無菌苗下胚軸為外植體，建立了大白菜高效、穩(wěn)定再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了轉(zhuǎn)基因抗性芽。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化效率最高的基因型為Seoul，最佳篩選培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA + 1 mg/L NAA + 2 mg/L AgNO₃ + 300 mg/L Car + 10 mg/L Hyg，共培養(yǎng)基pH 5.2，完全黑暗培養(yǎng)，侵染液濃度OD₆₀₀=0.5，侵染時(shí)間為10 min，在此條件下轉(zhuǎn)化效果最好。GUS染色結(jié)果表明，GUS基因已整合到抗性芽細(xì)胞的染色體中，能夠穩(wěn)定表達(dá)。

關(guān)鍵詞:大白菜;下胚軸;根癌農(nóng)桿菌;再生;遺傳轉(zhuǎn)化體系

中圖分類號(hào):S634.103.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2010)02-0001-07

大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)原產(chǎn)于中國，屬于十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)蕓薹種(B.campestris L.)中的栽培亞種群，有許多變種和類型，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。蕓薹屬植物中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)、小白菜、芥菜 、蕪菁等的遺傳轉(zhuǎn)化早已得到轉(zhuǎn)化植株。然而，具有AA基因組的大白菜與具有BB和CC基因組的其他蕓薹屬植物相比，外植體的離體再生能力最低[1]，使得大白菜的遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展緩慢。近年來國內(nèi)外學(xué)者在大白菜組織培養(yǎng)方面取得了較大進(jìn)展，已由大白菜腋芽[2]、真葉[3]、子葉[4~6]、下胚軸[5，6]、花藥及小孢子[7，8] 、花莖[9]等外植體得到了再生植株。但由于大白菜愈傷組織的植株再生頻率很低，遺傳轉(zhuǎn)化仍然很困難。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大白菜遺傳轉(zhuǎn)化中，下胚軸外植體的遺傳轉(zhuǎn)化效率顯著高于子葉外植體[10，11];而在有關(guān)大白菜不定芽再生的報(bào)道中，與子葉相比，下胚軸不定芽的再生頻率均很低，不利于大白菜高效遺傳轉(zhuǎn)化[12]。因此，對(duì)大白菜下胚軸外植體的再生做進(jìn)一步的研究很有必要。本試驗(yàn)以大白菜的下胚軸為外植體，研究了不同激素配比、不同基因型以及外植體苗齡、切段來源和接種方式等因素對(duì)不定芽再生的影響，建立以大白菜下胚軸為外植體的高效穩(wěn)定再生遺傳轉(zhuǎn)化體系，為利用基因工程技術(shù)改良大白菜品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料無菌苗的培養(yǎng)

大白菜品種:陽春、強(qiáng)勢(shì)、Seoul和Olympic，均購自先正達(dá)種子公司。種子在70%乙醇中表面消毒1 min后用2%次氯酸鈉消毒 15 min，無菌水沖洗3次，然后接種于1/2MS固體培養(yǎng)基，于(25±1)℃、完全黑暗條件下培養(yǎng)成苗。

1.2 根癌農(nóng)桿菌及其質(zhì)粒

根癌農(nóng)桿菌(Agrobactedum tumefaciens) 為LBA4404菌系。質(zhì)粒PCAMBIA1301帶有修飾的GUS基因(帶內(nèi)含子)和抗潮霉素B (Hyg)篩選基因。基因表達(dá)由啟動(dòng)子CaMV 35S調(diào)控。

1.3 大白菜高效再生體系的建立

將黑暗條件下培養(yǎng)5 d的幼苗下胚軸(長約8～10 cm)切成長度為0.6～0.9 cm的均勻小段，接種于分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d左右便可分化出不定芽。不定芽長到1.0～1.2 cm時(shí)，經(jīng)切分轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中;待基部形成根系后，打開培養(yǎng)瓶口，于培養(yǎng)箱內(nèi)煉苗1～2 d;而后取出小植株，洗凈根部培養(yǎng)基，再煉苗2～3 d，將其移入蛭石和基質(zhì)混合的培養(yǎng)缽中;生長2～3周后，將植株移栽土中。

1.4 影響外植體再生的因素

在外植體再生影響因子的設(shè)計(jì)處理中，分別以某一因子為變量，以對(duì)應(yīng)因子作對(duì)照，觀察各影響因子對(duì)再生頻率的影響，所有試驗(yàn)處理均設(shè)3次重復(fù)。不定芽再生頻率用不定芽分化率來表示，不定芽分化率(%)=分化芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

1.4.1 不同基因型 4個(gè)不同基因型陽春、強(qiáng)勢(shì)、Seoul、Olympic分別接種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，完全黑暗培養(yǎng)5 d后，將下胚軸切成適宜小段，平放在分化培養(yǎng)基中分化，3周左右統(tǒng)計(jì)不定芽分化率。

1.4.2 不同苗齡

以Seoul為試材，取苗齡3、5、7 d的無菌苗，分別切取0.6～0.9 cm下胚軸作外植體，平放在分化培養(yǎng)基中分化，3周左右統(tǒng)計(jì)再生頻率。

1.4.3 不同外植體切段及接種方式 以Seoul為試材，取苗齡5 d的無菌苗，切取0.6～0.9 cm下胚軸作外植體。分別取下胚軸外植體上、中、下切段按正插(形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基)、反插(形態(tài)學(xué)上端插入培養(yǎng)基)和平放三種不同方式接種于分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，3周左右統(tǒng)計(jì)再生頻率，比較不同切段、不同接種方式的外植體不定芽再生的差異。

1.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

1.5.1 根癌農(nóng)桿菌的活化及下胚軸侵染 進(jìn)行轉(zhuǎn)化的前一天，挑取劃線培養(yǎng)的單菌落接種在YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜(16 h)。次日以2%的接種量轉(zhuǎn)接于50 ml不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3～4 h，達(dá)到對(duì)數(shù)生長中期時(shí)，用MS₀液體培養(yǎng)基稀釋成不同濃度后，浸泡預(yù)培養(yǎng)3 d的大白菜下胚軸。之后取出下胚軸用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中，于25℃條件下培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上篩選。

1.5.2 轉(zhuǎn)化體的篩選和植株再生 共培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入含有潮霉素(Hyg)的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選和誘導(dǎo)芽分化，每?jī)芍芾^代一次。

1.5.3 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果的因素以Seoul為主要試材，在遺傳轉(zhuǎn)化各影響因子的設(shè)計(jì)處理中，分別以某一因子為變量，以對(duì)應(yīng)因子作對(duì)照，其它因子以上述轉(zhuǎn)化程序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，觀察各因子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。所有試驗(yàn)處理均設(shè)3次重復(fù)。轉(zhuǎn)化效率用抗性芽分化率來表示，抗性芽分化率(%)=再生抗性芽數(shù)/外植體總數(shù)×100。

①預(yù)培養(yǎng)天數(shù):外植體在1/2MS培養(yǎng)基上完全暗培養(yǎng)5 d后，切成長約0.7～0.9 cm的小段，分別接種到預(yù)培養(yǎng)基中0、3、5 d，用OD₆₀₀值為0.6～0.8的菌液侵染5 min，共培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。6～7周后，統(tǒng)計(jì)抗性芽分化率。

②共培養(yǎng)方式:外植體在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，侵染后分別置入pH 5.2、pH 5.8的共培養(yǎng)基中，觀察不同培養(yǎng)基對(duì)抗性芽分化率的影響。以pH 5.2的共培養(yǎng)基為準(zhǔn)，又進(jìn)行了光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)2種方式對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響試驗(yàn)。

③菌液濃度和侵染時(shí)間:將預(yù)培養(yǎng)3 d的下胚軸，分別在OD₆₀₀值為0.3、0.5、0.8、1.0的菌液中侵染10 min，在OD₆₀₀值為0.5的菌液中侵染2、5、10、20 min，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后接種到篩選培養(yǎng)基，6～7周后，統(tǒng)計(jì)抗性芽分化率。

④AgNO₃濃度:在預(yù)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)基及篩選培養(yǎng)基中加入一定量的AgNO₃，濃度分別設(shè)為0、2、4、10 mg/L，觀察對(duì)抗性芽分化率的影響。

⑤激素濃度及組合: 影響外植體再生頻率的主要因素是培養(yǎng)基中的激素濃度。以Seoul為材料，設(shè)置了不同濃度配比的6-BA與NAA(見表10)，以篩選最佳的激素濃度及組合。

⑥潮霉素(Hyg)濃度:外植體共培養(yǎng)2 d后，分別轉(zhuǎn)接到Hyg濃度為5、10、15 mg/L的篩選培養(yǎng)基上，6～7周后統(tǒng)計(jì)抗性芽分化率。

⑦GUS組織化學(xué)染色法鑒定抗性芽:將轉(zhuǎn)化侵染后在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～7周的抗性再生芽切下，37℃培養(yǎng)箱中GUS染液浸泡4 h左右，75%乙醇過夜脫色，進(jìn)一步鑒定再生抗性芽。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析用DPS軟件進(jìn)行方差分析，并對(duì)平均數(shù)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型、苗齡外植體對(duì)再生頻率的影響

許多研究表明，植物離體形態(tài)發(fā)生能力與其基因型有著密切的關(guān)系，不同基因型的植物其外植體的不定芽再生能力有顯著差異[13～16]。Dietert[17]早在1982年就認(rèn)識(shí)到基因型是限制大白菜不定芽再生的一個(gè)重要因素。將不同品種(雜交系)大白菜下胚軸接種于MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+2 mg/L AgNO₃培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果(表1)表明，不同基因型的不定芽再生頻率差異顯著。其中Seoul獲得再生不定芽的頻率最高(39.15%)，Olympic不定芽的再生頻率為23.26%;強(qiáng)勢(shì)只產(chǎn)生膨大愈傷組織，未長出不定芽;陽春偶爾會(huì)得到一個(gè)不定芽，但很容易玻璃化。Seoul愈傷組織和不定根較易產(chǎn)生，不定芽分化率較高，可見該品種在離體培養(yǎng)中細(xì)胞的生長、分化均較活躍，培養(yǎng)性能良好。

以Seoul為試材，研究了不同苗齡對(duì)再生頻率的影響，結(jié)果表明，3～5 d苗齡的大白菜下胚軸外植體再生能力無明顯差異(見表2)，以苗齡為5 d時(shí)不定芽的再生頻率最高，以后隨著苗齡的增加，不定芽再生頻率下降，苗齡為7 d時(shí)的不定芽再生頻率最低，這與朱麗華(2005)[18]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 下胚軸切段來源和接種方式對(duì)不定芽再生的影響

由表3可知，相同接種方式下，不同部位下胚軸的不定芽再生能力有很大差異。靠近生長點(diǎn)的上部切段再生能力較強(qiáng)，芽的再生頻率最高，其次為中部切段，下部切段再生能力較差。

接種方式對(duì)下胚軸不定芽分化也有顯著影響(表4)。相同部位的下胚軸切段，以不同方式接種到不定芽再生培養(yǎng)基上，都是先逐漸產(chǎn)生淺黃綠色疏松狀愈傷組織，一周后，愈傷組織迅速膨大并呈致密狀。此后，不同的接種方式表現(xiàn)出分化的差異，反插和正插的下胚軸接觸培養(yǎng)基的一端膨大得快，而且愈傷組織致密，芽點(diǎn)也較少，再生芽生長緩慢。平放的下胚軸一般兩端都有所膨大，但形態(tài)學(xué)下端較上端膨大得快而且大很多(圖1)。絕大多數(shù)平放的下胚軸在培養(yǎng)基上一般10 d左右出現(xiàn)芽點(diǎn)，3周左右分化成叢生芽，此時(shí)，愈傷呈白色透明狀(圖2)。

2.3 不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

在下胚軸感染根癌農(nóng)桿菌之前預(yù)培養(yǎng)3 d，抗性芽的再生率為4.19%，不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，直接用根癌農(nóng)桿菌侵染的抗性芽分化頻率為0.43%，預(yù)培養(yǎng)5 d后再感染根癌農(nóng)桿菌的抗性芽分化頻率為1.80%(表5)。這表明預(yù)培養(yǎng)對(duì)下胚軸分化是必需的，但是時(shí)間過長，下胚軸活性降低，感染農(nóng)桿菌后分化率降低。預(yù)培養(yǎng)可以減少傷害脅迫，調(diào)整細(xì)胞生理狀況，從而有利于根癌農(nóng)桿菌的侵染，同時(shí)可以減輕經(jīng)根癌農(nóng)桿菌侵染后的腐爛褐化。

2.4 不同共培養(yǎng)基及共培養(yǎng)方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

表6結(jié)果表明，pH 5.2和pH 5.8，以及光和黑暗共培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響差異不顯著，相比而言，黑暗條件和pH 5.2的共培養(yǎng)基更有利于抗性芽的分化。

2.5 菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響較大(表7、8)。菌液濃度過高或侵染時(shí)間過長，很容易導(dǎo)致外植體褐化死亡;菌液濃度過低或侵染時(shí)間過短，只會(huì)不斷地長愈傷，很難有抗性芽長出。從表7可知，當(dāng)菌液濃度為OD₆₀₀=0.5時(shí)，抗性芽分化率為4.20%，當(dāng)OD₆₀₀值為0.3、0.8、1.0時(shí)，抗性芽分化率都很低，尤其是在OD₆₀₀=1.0時(shí)，侵染后，農(nóng)桿菌常過度生長以致抑制不住，嚴(yán)重毒害外植體。

從表8可知，侵染時(shí)間為10 min時(shí)，抗性芽分化率最高，侵染時(shí)間延長至20 min時(shí)，幾乎所有外植體在培養(yǎng)過程中褐化死亡或者被過度生長的農(nóng)桿菌毒害死亡，很難獲得抗性芽。侵染時(shí)間為2 min和5 min時(shí)，抗性芽分化率也低。這表明，大白菜的下胚軸對(duì)農(nóng)桿菌的濃度和侵染時(shí)間都很敏感。因此，適宜的根癌農(nóng)桿菌侵染方法是成功轉(zhuǎn)化的重要條件。

2.6 AgNO₃濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

據(jù)Zhang 等[19]的報(bào)道，AgNO₃對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化中大白菜外植體再生是必需的。杜虹等[20]研究表明，大白菜的抗性芽分化率從不添加AgNO₃的28.2%提高到添加后的71.7%，但隨著AgNO₃含量的增加，抗性芽分化率也有所降低。王火旭等[21]認(rèn)為AgNO₃與ABA具有協(xié)同增效作用，其中AgNO₃是關(guān)鍵因子。本試驗(yàn)結(jié)果(表9)也表明，添加不同濃度的AgNO₃對(duì)下胚軸的轉(zhuǎn)化效率影響明顯，并且能有效誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，其中濃度為2 mg/L時(shí)效果最佳。

2.7 激素濃度及組合對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

6-芐基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)是誘導(dǎo)大白菜外植體分化不定芽最好的激素組合[22]。本試驗(yàn)在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的6 - BA和NAA組合成6種培養(yǎng)基(見表10) ，將Seoul的下胚軸分別接種在不同的培養(yǎng)基上，5 d左右下胚軸兩端切口處開始膨大，侵染后一周左右長出愈傷并不斷膨大，4周左右有抗性芽分化出來。其中，2號(hào)培養(yǎng)基的抗性芽分化率明顯高于其它培養(yǎng)基，可見對(duì)下胚軸的誘導(dǎo)需要較低濃度的6-BA和較高濃度的NAA，這與誘導(dǎo)子葉不定芽的激素濃度及比值不同[23]。

2.8 潮霉素(Hyg)濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

適當(dāng)濃度潮霉素對(duì)抗性芽的篩選很關(guān)鍵。Hyg濃度過高，對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞有很大的毒害作用，幾乎所有的外植體都會(huì)褐化死亡;Hyg濃度過低，對(duì)抗性芽不能進(jìn)行嚴(yán)格篩選，容易產(chǎn)生假抗性芽。表11表明，Hyg濃度在10 mg/L時(shí)，抗性芽分化率最高，為4.46%;濃度為5 mg/L時(shí)，再生率雖然也較高，但大多是假陽性的，抗性芽分化率很低，只有1.24%;濃度為15 mg/L時(shí)，外植體只長愈傷，而且很快就褐化死亡。所以，本試驗(yàn)表明在篩選培養(yǎng)基中添加濃度為10 mg/L的潮霉素，對(duì)大白菜抗性芽的篩選最有效。

2.9 抗性芽的GUS組織化學(xué)染色法鑒定

下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，放到共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，進(jìn)行GUS瞬時(shí)染色分析，下胚軸被染成藍(lán)色(圖3)，說明外源基因已經(jīng)進(jìn)入植物細(xì)胞體內(nèi)并且表達(dá)。

下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，共培養(yǎng)2 d，將外植體置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天左右有抗性愈傷長出，3周后抗性愈傷上分化出抗性芽。取愈傷組織及芽染色后發(fā)現(xiàn)變成藍(lán)色(圖3、圖4)，說明GUS基因已經(jīng)整合進(jìn)細(xì)胞的染色體中，并且穩(wěn)定表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

建立高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)再生體系是用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因植株的重要前提。本試驗(yàn)在研究大白菜下胚軸高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的過程中，發(fā)現(xiàn)不同基因型和苗齡的外植體、下胚軸切段來源和接種方式、不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)、不同共培養(yǎng)基及共培養(yǎng)方式、菌液濃度、激素配比、AgNO₃以及潮霉素的濃度都對(duì)其有不同程度的影響。本試驗(yàn)中，最佳基因型是Seoul，以下胚軸為外植體，在預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，最佳篩選培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+ 1 mg/L NAA+2 mg/L AgNO₃+300 mg/L Car+10 mg/L Hyg，共培養(yǎng)基pH 5.2，侵染液OD₆₀₀=0.5，侵染時(shí)間為10 min，完全黑暗條件下共培養(yǎng)2 d時(shí)，其轉(zhuǎn)化效率最高。

外植體的苗齡影響不定芽的再生，其機(jī)理可能是不同苗齡的外植體，細(xì)胞中基因表達(dá)的狀態(tài)不同，在離體條件下對(duì)外界因子的誘導(dǎo)反應(yīng)不同。外植體苗齡越小分化能力越強(qiáng)，其機(jī)理可能是此時(shí)切面的薄壁細(xì)胞具有較高的再生能力，苗齡較高的外植體切面細(xì)胞已經(jīng)開始分化，細(xì)胞分裂能力逐漸降低，故再生頻率較低。

以往研究表明，不同的共培養(yǎng)方式會(huì)影響大白菜的轉(zhuǎn)化效率，但本試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 5.2和pH 5.8以及光和黑暗條件下共培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響差異不顯著。這與楊廣東等[24]的結(jié)果有一定出入，可能與采用的外植體不同有關(guān)。

AgNO₃在組織培養(yǎng)中的作用很早就在很多植物上得到證實(shí)。Chi等[25]首先發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加AgNO₃能顯著促進(jìn)大白菜的子葉再生成芽。本試驗(yàn)結(jié)果其濃度為2 mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)化效果最佳。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，種子在完全黑暗條件下萌發(fā)5 d，預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，根癌農(nóng)桿菌LBA4404侵染10 min后，完全黑暗條件下共培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，結(jié)果， 10 d左右有抗性愈傷長出，3周后抗性愈傷上分化出抗性芽。但從抗性芽很難得到陽性植株，原因可能是:所用大白菜品種為一代雜交種，其分化能力差，陽性芽褐化嚴(yán)重，極易死亡。在今后的試驗(yàn)中，還需要進(jìn)一步摸索防褐化條件，減少抗性芽的死亡，以獲得轉(zhuǎn)基因植株。

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