摘 要:以黑曲霉C-2為菌種，對蘋果渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶的活性為測定指標(biāo)，單因素試驗(yàn)確定水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)對產(chǎn)復(fù)合酶體系的固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，同時運(yùn)用極差分析、方差分析以及不同因素水平間差異顯著性檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行分析，以得到較合理的培養(yǎng)基。優(yōu)化后培養(yǎng)基組成為果渣∶麩皮=4∶1，2.0%硫酸銨，0.1%磷酸氫二鉀，2.5%尿素。優(yōu)化后三種酶活力比基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別提高了64.19%、17.26%、20.89%。

關(guān)鍵詞:蘋果渣;固態(tài)發(fā)酵;復(fù)合酶;培養(yǎng)基;優(yōu)化

中圖分類號:TS202.3文獻(xiàn)標(biāo)識號:A文章編號:1001-4942(2010)01-0080-06

Optimization of Solid-state Fermentation Medium for Production

of Complex Enzymes with Apple Pomace

JIANG Xin1， CHEN Wei1*， ZHOU Bo2*

(1.College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China;2.

College of Life Science， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China)

Abstract With the activity of cellulase， xylanase and pectinase as the determination indicators， the optimization of medium composition was investigated in solid-state fermentation of apple pomace by Aspergillus niger C-2. The culture medium was optimized using L9 (34) orthogonal design， range analysis， variance analysis and test of significance between the levels of different factors ， so as to get a more reasonable result.As the result， the optimized medium composition was apple pomace∶bran = 4∶1， ammonium sulfate of 2.0%， potassium hydrogen phosphate of 0.1%， urea of 2.5%. Compared with the basic medium， the activity of three enzyme was increased by 64.19%，17.26% and 20.89%， respectively.

Key words Apple pomace; Solid-state fermentation; Complex enzyme; Medium; Optimization

蘋果渣是指蘋果榨汁后的副產(chǎn)物，主要由果皮、果核和殘余果肉組成，約占鮮果質(zhì)量的25%。我國年產(chǎn)蘋果約2 000×104 t，在加工果汁的過程中所排出的果渣約有100×104 t。由于蘋果渣含有較高水分(約75%~80%)和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，易被微生物侵染，發(fā)霉、腐爛變質(zhì)，導(dǎo)致環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[1，2]。蘋果加工后的大量殘渣含有果膠、纖維素和蛋白質(zhì)等，可作為飼料、提取膳食纖維、果膠原料的來源、培養(yǎng)食用菌、提取低聚糖、生產(chǎn)酶等等。該領(lǐng)域的商品開發(fā)在國內(nèi)外都尚處于起步階段，如何利用這種食品下腳料是當(dāng)前的研究及開發(fā)熱點(diǎn)[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

干蘋果渣:由天津牧光生物有限公司提供，pH 4.6。

菌種:黑曲霉C-2(Aspergillus niger)，為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心保藏。

1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基為:麩皮200 g，玉米芯40 g，加水煮沸30 min，過濾，加入2.0%硫酸銨，0.2%磷酸氫二鉀，補(bǔ)水到1 L。

固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蘋果渣(烘干)15 g，2.0%硫酸銨，pH自然，發(fā)酵周期2 d，10%接種量，固水比=1∶1。

1.3 測定方法

本試驗(yàn)測定三種酶活性，即纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶。方法為DNS法[4]。

酶活單位定義:在40℃、pH值為4.6的條件下，每分鐘從濃度為5 mg/ml的底物溶液中分解釋放1 μmol還原物質(zhì)所需要的酶量為一個酶活單位U。

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計

通過前期單因素試驗(yàn)，確定硫酸銨添加量(A)，磷酸氫二鉀添加量(B)，尿素添加量(C)，果渣和麩皮的添加比例(D)4個因素，各取3個水平，以發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶3種酶活性大小作為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，控制發(fā)酵時間為48 h。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1正交試驗(yàn)因素與水平(%)

水平因素硫酸銨(A)磷酸氫二鉀(B)尿素(C)果渣∶麩皮(D)

11.00.11.51∶1

22.00.22.04∶1

33.00.42.52∶1

1.5 分析方法

運(yùn)用DPS v7.05軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計和分析，正交試驗(yàn)方差分析時選用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，用Origin75做圖，用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵周期的確定

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵微生物，每12 h測定發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶活性，找到最大酶活產(chǎn)生的時間，即最佳發(fā)酵時間。

由圖1可以看出，纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶活性在發(fā)酵前期48 h內(nèi)快速增加，48 h達(dá)到酶活最大值，此時纖維素酶活為(66.72±0.049)U/g，木聚糖酶活為(363.78±4.085)U/g，果膠酶活為(732.46±2.055)U/g。此后，菌體開始有孢子出現(xiàn)，96 h達(dá)到酶活值的第二個高峰，但此時菌體孢子致密，之后酶活值下降。也就是說大部分酶是在菌絲旺盛生長時產(chǎn)生的，因此48 h為該菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)時間。

圖1 三種酶活力隨時間變化規(guī)律

2.2 含水量對酶活性的影響

2.2.1 料水比對酶活性的影響 料水比是指果渣麩皮與水的比值。料水比越大，發(fā)酵物的粘度越大，物料的通透性越差，發(fā)酵溫度較高，對菌體生長影響較大，酶活性會下降。因此選擇適宜的料水比，增加物料通透性是發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵。設(shè)計料水比分別為1∶0.5、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.6，測定不同的料水比對三種酶活力的影響。

從圖2中可以看出，當(dāng)料水比為1∶0.51∶0.8時，三種酶活相對偏低;當(dāng)料水比為1∶1.2時，三種酶活達(dá)到最大值;當(dāng)料水比>1∶1.2時，

圖2 三種酶活力隨料水比變化規(guī)律

酶活有所下降。說明水分太少會導(dǎo)致菌體脫水，不能進(jìn)行正常的生長代謝;而水分太多，底物變得黏稠，只有表面接觸到空氣的部分可以生長孢子，而靠近瓶底的深層部分因?yàn)榻佑|不到空氣，而降低了酶的活性。所以料水比確定為1∶1.2。

2.2.2 發(fā)酵過程中水分變化的測定 含水量是指物料含水的多少。含水量較高，物料多孔性降低，減少了物料內(nèi)氣體的體積和氣體交換，難以通風(fēng)、降溫，增加雜菌污染的危險;含水量低時，物料膨脹程度低，微生物生長受抑制，后期由于微生物生長及水分蒸發(fā)造成物料較干，微生物難以生長，產(chǎn)量降低，影響產(chǎn)品質(zhì)量[5]。在料水比1∶1.2的情況下，不補(bǔ)水，每24 h測定培養(yǎng)基的水分含量。取0、1、2、3、4、5 d的固體發(fā)酵培養(yǎng)基1 g，放入烘箱105℃，烘烤24 h，測定水分消耗率，每組3個平行。

由圖3可以看出，在發(fā)酵前3天，水分變化相對平穩(wěn)，以每天3%左右的百分率消耗，3天后水分消耗加劇。所以應(yīng)適量補(bǔ)充水分，以滿足微生物的正常生長。補(bǔ)水量為每瓶培養(yǎng)基每天補(bǔ)水1 ml。

圖3 發(fā)酵過程中水分變化規(guī)律

2.2.3 補(bǔ)水與不補(bǔ)水對酶活性的影響 將每瓶培養(yǎng)基發(fā)酵2 d，不補(bǔ)水，測定酶活;將培養(yǎng)基發(fā)酵2 d，每天補(bǔ)水1 ml/瓶，測定酶活，將兩者對比，看是否需要補(bǔ)水。三種酶活變化分別見圖4。

由圖4可以看出，發(fā)酵第1天補(bǔ)水處理的三種酶活性均有所降低，第2、3天補(bǔ)水后三種酶活性都增加。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵第1天，培養(yǎng)基本身水分適宜，補(bǔ)水后，水分含量過高，造成培養(yǎng)基透氣性差，菌體生長不良，產(chǎn)酶效果不好。發(fā)酵的后兩天，由于菌體生長、產(chǎn)熱消耗了一部分水分，水分含量偏低;補(bǔ)水后三種酶活性均有小幅度的增長，說明補(bǔ)水后水分含量適宜菌體生長，產(chǎn)酶效果良好。所以應(yīng)從發(fā)酵第2天開始，每天補(bǔ)水1ml/瓶，對酶活有一定的提高作用。

圖4 補(bǔ)水與不補(bǔ)水三種酶活隨發(fā)酵時間變化

2.3 三種酶活性正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 正交試驗(yàn)纖維素酶活結(jié)果 由表2的R值分析可知，A>C>D>B，對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)纖維素酶活影響最大的因素是硫酸銨添加量，其次是尿素添加量，再次是果渣和麩皮的比例，磷酸氫二鉀添加量影響最小。

表2正交試驗(yàn)纖維素酶活結(jié)果

試驗(yàn)號硫酸銨(A)磷酸氫二鉀(B)尿素(C)果渣∶麩皮(D)纖維素酶活性(U/g)

1111129.58 32.32

2122232.90 33.68

3133334.39 35.23

4212332.9 35.36

5223131.64 34.50

6231231.73 33.91

7313230.46 33.20

8321328.32 28.65

9332126.30 27.36

K1198.10193.82184.50181.70

K2200.04189.69188.50195.87

K3174.29188.91199.42194.85

K1平均33.0232.3030.7530.28

K2平均33.3431.6131.4232.65

K3平均29.0531.4933.2432.48

R4.290.812.492.37

運(yùn)用DPS v7.05軟件進(jìn)行方差分析，選用Duncan 新復(fù)極差法作多重比較。由方差分析表3可以看出，硫酸銨添加量、尿素添加量和果渣麩皮比例對纖維素酶活的影響極顯著;而磷酸氫二鉀添加量對纖維素酶活影響不顯著。

表3 正交設(shè)計纖維素酶活方差分析表

(隨機(jī)區(qū)組模型)

變異來源平方和自由度均方F值顯著性

區(qū)組14.1867114.1867

第1列68.5105234.255267.4281**

第2列2.320721.16042.2841不顯著

第3列19.880729.940419.5666**

第4列20.8195210.409820.4906**

誤差4.064280.5080

總和129.7824

由表4可以看出，處理因子A的水平2與水平1差異不顯著，但均與水平3差異顯著，即硫酸銨添加量選擇水平2和水平1對纖維素酶活都有利，為了得到最大活性，選擇水平2，即硫酸銨2.0%。處理因子B的3個水平之間差異不顯著，按照最經(jīng)濟(jì)的原則，選擇水平1，即磷酸氫二鉀0.1%。處理因子C的水平3與水平2、1之間差異顯著，后兩者之間差異不顯著，為得到最大活性，選擇水平3，即尿素2.5%。處理因子D的水平2、3差異不顯著，均與水平1差異顯著。本試驗(yàn)的原料果渣廉價易得，且為主要利用物，故選擇水平2，即果渣∶麩皮=4∶1。

表4不同因素水平間差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

硫酸銨(A)水平均值5%顯著水平磷酸氫二鉀(B)水平均值5%顯著水平尿素(C)水平均值5%顯著水平果渣∶麩皮(D)水平均值5%顯著水平

233.3383a132.3033a333.2367a232.6450a

133.0167a231.6150a231.4167b332.4750a

329.0483b331.4850a130.7500b130.2833b

綜上分析得:纖維素酶活最好的試驗(yàn)組合為A2B1C3D2，即最優(yōu)培養(yǎng)基組成為硫酸銨2.0%，磷酸氫二鉀0.1%，尿素2.5%，果渣∶麩皮=4∶1。

2.3.2 正交試驗(yàn)?zāi)揪厶敲富罱Y(jié)果 由表5的R值分析可知，A>C>D>B，對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)木聚糖酶活影響最大的因素是硫酸銨添加量，其次是尿素添加量，再次是果渣和麩皮的比例，磷酸氫二鉀添加量影響最小。

表5正交試驗(yàn)?zāi)揪厶敲富罱Y(jié)果

試驗(yàn)號硫酸銨(A)磷酸氫二鉀(B)尿素(C)果渣∶麩皮(D)木聚糖酶活性(U/g)

11111321.03 332.4

21222534.35 542.24

31333471.32 473.29

42123536.39 578.43

52231645.06 652.37

62312504.14 502.78

73132441.43 431.54

83213131.28 132.42

93321306.16 307.26

K12674.632641.221924.052564.28

K23419.172637.722804.832956.48

K31750.092564.953115.012323.13

K1平均445.77440.20320.68427.38

K2平均569.86439.62467.47492.75

K3平均291.68427.49519.17387.19

R278.1812.71198.49105.56

由方差分析(表6)可以看出，硫酸銨添加量、尿素添加量、果渣麩皮比例對木聚糖酶活的影響極顯著;磷酸氫二鉀對木聚糖酶活影響不顯著。

表6 正交設(shè)計木聚糖酶活方差分析表

(隨機(jī)區(qū)組模型)

變異來源平方和自由度均方F值顯著性

區(qū)組210.60361210.6036

第1列233052.33722116526.16861098.5445**

第2列618.04642309.02322.9133不顯著

第3列127242.8201263621.4101599.7876**

第4列34061.4658217030.7329160.5564**

誤差848.58588106.0732

總和396033.8590

由表7可以看出，處理因子A的3個水平間差異顯著，選擇水平2為最佳，即硫酸銨2.0%。處理因子B的3個水平差異不顯著，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇水平1，即磷酸氫二鉀0.1%。處理因子C的3個水平間差異顯著，選擇水平3最佳，即尿素2.5%。處理因子D的3個水平差異顯著，選擇水平2，即果渣∶麩皮=4∶1。

綜合上述分析可知，木聚糖酶活最好的試驗(yàn)組合為A2B1C3D2，即最優(yōu)培養(yǎng)基組成為硫酸銨2.0%，磷酸氫二鉀0.1%，尿素2.5%，果渣∶麩皮=4∶1。

表7不同因素水平間差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

硫酸銨(A)水平均值5%顯著水平磷酸氫二鉀(B)水平均值5%顯著水平尿 素(C)水平均值5%顯著水平果渣∶麩皮(D)水平均值5%顯著水平

2569.8617a1440.2033a3519.1683a2492.7467a

1445.7717b2439.6200a2467.4717b1427.3800b

3291.6817c3427.4917a1320.6750c3387.1883c

2.3.3 正交試驗(yàn)果膠酶活結(jié)果 由表8的 R值可知，D>A>B>C，對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)果膠酶活影響最大的因素是果渣和麩皮的比例，其次是硫酸銨添加量，再次是磷酸氫二鉀添加量，而尿素添加量影響最小。

表8正交試驗(yàn)果膠酶活結(jié)果

試驗(yàn)號硫酸銨(A)磷酸氫二鉀(B)尿素(C)果渣∶麩皮(D)果膠酶活性(U/g)

11111580.63 577.32

21222806.34 798.67

31333776.45 767.67

42123808.67 853.23

52231587.75 577.68

62312820.78 832.89

73132702.26 696.56

83213699.66 690.23

93321450.24 463.24

K14307.084218.674201.513236.86

K24481.004160.334180.394657.50

K33702.194111.274108.374595.91

K1平均717.8467703.1117700.2517539.4767

K2平均746.8333693.3883696.7317776.2500

K3平均617.0317685.2117684.7283765.9850

R129.801717.900015.5233236.7733

由方差分析(表9)可以看出，硫酸銨添加量、果渣麩皮比例對果膠酶活影響都極顯著，尿素添加量、磷酸氫二鉀添加量對果膠酶活影響不顯著。

表9 正交設(shè)計果膠酶活方差分析

(隨機(jī)區(qū)組模型)

變異來源平方和自由度均方F值顯著性

區(qū)組33.9213133.9213

第1列55704.7275227852.3637171.1953**

第2列963.62222481.81112.9615不顯著

第3列794.88862397.44432.4429不顯著

第4列214946.01332107473.0067660.5857**

誤差1301.54818162.6935

總和273744.7210

由表10可知，處理因子A的3個水平之間差異顯著，水平2最好;處理因子B的水平1最好;處理因子C的水平間差異不顯著，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，低添加量最好，選擇水平1;處理因子D的水平2、3間差異不顯著，均顯著高于水平1，選擇水平2。

綜合上述分析，果膠酶活最好的試驗(yàn)組合為A2B1C1D2，即最優(yōu)培養(yǎng)基組成為硫酸銨2.0%，磷酸氫二鉀0.1%，尿素1.5%，果渣∶麩皮=4∶1。

表10不同因素水平間差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

硫酸銨(A)水平均值5%顯著水平磷酸氫二鉀(B)水平均值5%顯著水平尿 素(C)水平均值5%顯著水平果渣∶麩皮(D)水平均值5%顯著水平

2746.8333a1703.1117a1700.2517a2776.2500a

1717.8467b2693.3883ab2696.7317a3765.9850a

3617.0317c3685.2117b3684.7283a1539.4767b2.3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果的分析 對上述正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，纖維素酶活最好的試驗(yàn)組合為A2B1C3D2，木聚糖酶活為A2B1C3D2，果膠酶活為A2B1C1D2，可以看出，三種酶活對培養(yǎng)基的硫酸銨、磷酸氫二鉀、果渣麩皮比例要求一致，分別為2.0%、0.1%和4∶1;而在尿素的添加量上存在差異，纖維素酶和木聚糖酶的最適添加量為2.5%，而果膠酶要求1.5%。 

試驗(yàn)的目的是得出三種酶活都較高的最適培養(yǎng)基，所以對尿素的添加量需要統(tǒng)一。對三個方差分析表進(jìn)行綜合分析，尿素添加量對纖維素酶活和木聚糖酶活的影響極顯著，而對果膠酶活影響不顯著。從這點(diǎn)上看，尿素添加量最終選定為2.5%。

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)復(fù)合酶本身是一個混合體系，所以應(yīng)選擇三種酶活性均較高的優(yōu)化組合。本試驗(yàn)得到蘋果渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)復(fù)合酶優(yōu)化后培養(yǎng)基配方:硫酸銨2.0%，磷酸氫二鉀0.1%，尿素2.5%，果渣∶麩皮=4∶1。

2.4 補(bǔ)充試驗(yàn)

將蘋果渣按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化后培養(yǎng)基配方進(jìn)行發(fā)酵，48 h后比較三種酶活的大小?；A(chǔ)培養(yǎng)基:纖維素酶活(U/g)為66.72±0.049，木聚糖酶活363.78±4.085，果膠酶活732.46±2.055;優(yōu)化后培養(yǎng)基:纖維素酶活為109.55±0.124，木聚糖酶活426.56±2.130，果膠酶活885.50±3.015。采用優(yōu)化后培養(yǎng)基，三種酶活分別較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了64.19%、17.26%、20.89%。

3 結(jié)論

3.1 最佳發(fā)酵周期的確定:以基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵微生物，每12 h測定發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶活性，探索最大酶活產(chǎn)生的時間，得到最佳發(fā)酵時間為48 h。

3.2 最佳料水比確定為1∶1.2。發(fā)酵過程中水分的變化測定發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前3天，水分變化相對平穩(wěn)，以每天3%左右的百分率消耗，此后水分消耗加大，應(yīng)每天補(bǔ)水1 ml/瓶。補(bǔ)水與不補(bǔ)水的對比試驗(yàn)表明，補(bǔ)水后三種酶活均有小幅度增大，但發(fā)酵第1天例外，因?yàn)榘l(fā)酵初期培養(yǎng)基水分含量高，此時補(bǔ)水會造成通氧效果差，影響菌體生長。發(fā)酵中由于產(chǎn)熱，消耗水分，所以從發(fā)酵第2天起，每天補(bǔ)水1 ml/瓶，對酶活有一定的提高作用。

3.3 通過正交試驗(yàn)，同時運(yùn)用極差分析、方差分析以及不同因素水平間差異顯著性檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行分析，確定優(yōu)化后培養(yǎng)基配方為:硫酸銨2.0%，磷酸氫二鉀0.1%，尿素2.5%，果渣∶麩皮=4∶1。優(yōu)化后的三種酶活比基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別提高了64.19%、17.26%和20.89%。

致謝:承蒙山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院于金鳳教授幫助分析數(shù)據(jù)，謹(jǐn)致謝意。

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