摘 要:利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入得到棉花雄性不育突變體，與野生型陸地棉(Gossypium hirsutum L.)Coker312雜交得到F1代。F1代植株出現(xiàn)了不育與可育兩種性狀的分離，分離比是1∶1。對F1代進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、卡那霉素和除草劑抗性鑒定、PCR擴(kuò)增檢測以及遺傳學(xué)分析，證實(shí)雄性不育突變性狀的表現(xiàn)與T-DNA插入共分離，從而認(rèn)為突變是由T-DNA插入引起的顯性雜合突變，這為利用T-DNA標(biāo)簽法進(jìn)行雄性不育有關(guān)基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:棉花;T-DNA;雄性不育突變體;遺傳分析

中圖分類號:S562.035.3文獻(xiàn)標(biāo)識號:A文章編號:1001-4942(2010)01-0022-04

Genetic Analysis of Cotton Male Sterile Mutant by T-DNA Tagging

ZHANG YU-qin1，2， GAO Jun-ping2， ZHANG Jin3，WANG Fu-rong2，ZHANG Jun2

(1.College of Life Science， Shandong Normal University， Jinan 250014，China;2.Shandong Subcenter of National Cotton Genetic Improvement Center of P.R.China/Shandong Cotton Research Center， Jinan 250100，China;3.College of Life Science， Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)

Abstract A male sterile mutant by T-DNA insertion was crossed with a wild type upland cotton (Gossypium hirsutum L.) cultivar Coker312.The segregation ratio of male sterile to male fertile was 1∶1 in generation F1.The results of morphological observation， kanamycin and herbicide resistance assay， PCR identification and corresponding genetic analysis showed that the male sterile was co-segregated with the T-DNA insertion.This male sterile mutant was considered as dominant heterozygous mutation caused by the T-DNA insertion，which would lay the basis for cloning the male sterile related genes of upland cotton by T-DNA tagging.

Key wordsUpland cotton;T-DNA;Male sterile mutant;Genetic analysis

在植物的基因克隆和功能分析研究中有許多種策略，利用突變體就是其中之一[1]。產(chǎn)生突變體的方法主要有理化誘變、T-DNA 插入、轉(zhuǎn)座子插入等[2]。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA標(biāo)簽法[3]是目前研究植物功能基因組最有效、使用最廣泛的手段，據(jù)統(tǒng)計(jì)有40%的擬南芥突變基因是用T-DNA標(biāo)簽法克隆的[4]。對這些基因的功能研究和利用將為提高作物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性提供更有效的途徑。

棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，提高皮棉產(chǎn)量和纖維品質(zhì)具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。目前利用不同品種間的雜交優(yōu)勢是提高皮棉產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的主要手段。但大面積推廣的組合，仍然以人工去雄授粉為主，制種成本過高已經(jīng)成為棉花雜種優(yōu)勢利用的主要限制因素[5]。因此，利用基因工程手段克隆育性相關(guān)基因并加以利用創(chuàng)造理想的雄性不育系，就成為提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的新途徑。

本研究利用野生型Coker312花粉與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入得到的T0代轉(zhuǎn)基因棉花雄性不育突變體雜交，獲得F1代植株。在對F1代植株進(jìn)行育性觀察、卡那霉素和除草劑抗性鑒定、PCR擴(kuò)增檢測的基礎(chǔ)上，對突變體進(jìn)行遺傳分析，為下一步利用T-DNA標(biāo)簽法[6]克隆與棉花雄性不育相關(guān)的基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生型陸地棉(Gossypium hirsutum L.)品系Coker312，T-DNA 插入得到的雄性不育突變體T0代植株。

1.2 育性鑒定

將雄性不育突變體與野生型Coker312雜交得到的F1代以及F1代不育株與Coker312雜交得到的F2代，種植于溫室和臨清試驗(yàn)田，以野生型Coker312為對照，進(jìn)行表型觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 卡那霉素和除草劑抗性鑒定

將脫脂棉撕成小條蘸取500 mg/L的卡那霉素溶液涂抹棉花葉片，5 d后統(tǒng)計(jì)抗性植株和非抗性植株比例[7]。同樣用脫脂棉條蘸取1%的草甘膦溶液涂抹棉花葉片，統(tǒng)計(jì)抗性植株和非抗性植株比例。

1.4 轉(zhuǎn)基因棉花的分子鑒定

按照王芙蓉等[8]改進(jìn)的CTAB法從棉花葉片中提取總DNA，參照T-DNA上含有的抗草甘膦基因和NPTⅡ基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行抗草甘膦基因和NPTⅡ基因PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。

表1 用于擴(kuò)增T-DNA上特異片段的PCR引物序列

引物名稱引物序列( 5'-3')

GR-fTTTACAAGTGGCCACCTAGCT

GR-rTGGTTCGTGTCTCATGCACTT

NPTII-fCCTGTCCGGTGCCCTGAATGAAC

NPTII-rCCACACCCAGCCGGCCACAGTCG

2 結(jié)果與分析

2.1 雄性不育突變體性狀表現(xiàn)

從T-DNA插入株系中獲得了一個突變體，該突變體葉片和株高發(fā)育正常，但花絲短，柱頭較長，花藥不開裂，不能正常散粉，進(jìn)行自交后不結(jié)鈴。利用Coker312花粉進(jìn)行人工授粉后結(jié)鈴并獲得種子，說明該突變體柱頭發(fā)育正常，雄蕊發(fā)育異常，屬于雄性不育突變體(圖1)。對該突變體進(jìn)行全生育期的觀察，雄性不育突變表型在生長發(fā)育過程中表現(xiàn)穩(wěn)定。

A為突變體雄性不育花;B為野生型正?；?/p>

圖1 T-DNA插入突變體雄性不育表型

2.2 遺傳分析

將突變體與野生型Coker312雜交得到的F1代種植于溫室和臨清試驗(yàn)田，以野生型Coker312為對照，進(jìn)行表型分析。F1代共41株，19株表現(xiàn)為雄性不育，22株可育，符合1∶1的分離假設(shè)(χ2C = 0.220 < χ20.05 = 3.84)，據(jù)此我們認(rèn)為該突變類似于顯性突變。為驗(yàn)證突變性狀的穩(wěn)定性，將F1代分離出的不育株再授以Coker312的花粉，得到F2代植株共185株，有90株表現(xiàn)雄性不育，95株可育，分離比仍然是1∶1(χ2C = 0.135 < χ20.05 = 3.84)，結(jié)果與F1代完全一致，進(jìn)一步證明該突變是顯性雜合突變。

2.3 卡那霉素和除草劑抗性鑒定

由于T-DNA區(qū)含有抗草甘膦基因和NPTⅡ基因(圖2)，對卡那霉素和除草劑有抗性，因此可對F1代進(jìn)行抗性鑒定。用500 mg/L的卡那霉素溶液涂抹F1代棉花葉片，處理5 d后F1代中19株雄性不育棉花的葉片沒有任何斑點(diǎn)，正常生長，顯示出明顯的抗性;22株可育棉花的葉片處理部位出現(xiàn)黃斑、萎縮。除草劑抗性的表現(xiàn)與卡那霉素鑒定的結(jié)果一致。從而證實(shí)，突變體植株具有明顯的野生型植株所不具備的抗性，卡那霉素和除草劑抗性表現(xiàn)與育性表型一致，表明雄性不育

注:水平箭頭示引物的位置

圖2 插入到棉花基因組中的T-DNA結(jié)構(gòu)

突變性狀與卡那霉素和除草劑抗性基因共分離。

2.4 轉(zhuǎn)基因棉花的分子鑒定

為了從分子水平上驗(yàn)證突變是否與T-DNA插入有關(guān)，對F1代中的41株進(jìn)行抗草甘膦基因和NPTⅡ基因的PCR擴(kuò)增。利用引物GR-f、GR-r擴(kuò)增抗草甘膦基因(圖3上圖);利用引物NPTⅡ-f和NPTⅡ-r擴(kuò)增NPTⅡ基因(圖3下圖)。結(jié)果表明F1代中，19株不育植株能擴(kuò)增出一條抗草甘膦的1 199 bp片段和一條NPTⅡ的488 bp片段(圖的第1、4泳道);而育性正常的22株植株(如泳道2、3、5)中均無特異性的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。即基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果、卡那霉素和除草劑鑒定結(jié)果與棉花育性表型具有一致性。表現(xiàn)為:轉(zhuǎn)基因F1代棉花中有19株雄性不育棉花同時具有卡那霉素和除草劑抗性，并可擴(kuò)增出抗草甘膦基因和NPTⅡ基因的特異性片段;22株育性正常棉花不具有卡那霉素和除草劑抗性，也無特異性條帶擴(kuò)增。這也表明雄性不育突變性狀與抗草甘膦基因和NPTⅡ基因共分離，即雄性不育突變性狀與T-DNA的插入相關(guān)，提示該突變體可能含有單個T-DNA插入位點(diǎn)且與T-DNA共分離，因此可以通過T-DNA標(biāo)簽法分離突變基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，利用研究得到的T-DNA插入位點(diǎn)的基因組序列設(shè)計(jì)引物組合，擴(kuò)增突變體基因組和野生型基因組。如果突變體是純合體，由于T-DNA的間隔，PCR就不會有

圖3 棉花基因組中T-DNA上的抗草甘膦基因(上圖) 和NPTII基因(下圖)的PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果突變體和野生型得到了相同的擴(kuò)增結(jié)果(結(jié)果未顯示)，并且巢式引物也說明了反應(yīng)產(chǎn)物是特異性產(chǎn)物，充分說明F1代突變體為雜合體，突變?yōu)轱@性突變。因而，從分子水平證實(shí)該突變是顯性雜合突變。

3 討論與結(jié)論

突變體是遺傳學(xué)研究的基本材料，在植物的基因克隆和功能分析研究中有重要作用。T-DNA標(biāo)簽法是研究植物功能基因組最有效、使用最廣泛的人工誘導(dǎo)產(chǎn)生突變體的手段，其優(yōu)點(diǎn)是一旦確定突變性狀由T-DNA插入引起， 就可以通過測定T-DNA的旁側(cè)序列而快速分離到相應(yīng)的突變基因[6]。目前利用不同棉花品種間的雜交優(yōu)勢是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的主要手段。但人工去雄、授粉創(chuàng)造雜交組合使得制種成本過高，已成為限制雜種優(yōu)勢利用的主要因素。雖然已從棉花中鑒定出了一些不同類型的雄性不育系，但一直難以在雜交制種中應(yīng)用[5]。因此，可以利用T-DNA標(biāo)簽法克隆育性相關(guān)的基因，研究雄性不育的分子機(jī)理，并加以利用，創(chuàng)造理想的棉花雄性不育系類型。

本研究利用T-DNA插入得到雄性不育的T0代突變體，用野生型Coker312花粉與之雜交獲得F1代植株。F1代以及F2代植株均出現(xiàn)1∶1的育性分離，與卡那霉素和除草劑抗性鑒定以及PCR檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步的分子鑒定結(jié)果證實(shí)突變是由T-DNA插入引起的顯性雜合突變，因此可以通過測定T-DNA的旁側(cè)序列而快速分離到相應(yīng)的突變基因。大多數(shù)情況下，雄性不育表型是純合的隱性基因(ms/ms)造成的，雜合(+/ms)具有正常的花粉。該基因座位可能蘊(yùn)含了一種新的雄性不育的遺傳機(jī)制。對該位點(diǎn)及其附近基因的克隆，及其在棉花生殖發(fā)育中的功能研究，將有助于更好地了解棉花的生殖發(fā)育，為棉花雄性不育機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而可能成為促進(jìn)雜種優(yōu)勢利用，提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的新途徑。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] Richards S J， Hill A，Hillmen P.Recent advances in the diagnosis， monitoring and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Cytometry B.Clin.Cytom.， 2007，