摘 要:利用榅桲莖尖進(jìn)行繼代培養(yǎng)，建立了榅桲的離體再生體系。結(jié)果表明，適合離體葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2MS+KT 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L;適合愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基為MS+ TDZ 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L;適合葉片再生不定芽的培養(yǎng)基為MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L;適合榅桲莖段生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IAA 0.3 mg/L+蔗糖30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L。

關(guān)鍵詞:榅桲;愈傷誘導(dǎo);植株再生;生根誘導(dǎo)

中圖分類號:S661.94+3文獻(xiàn)標(biāo)識號:A文章編號:1001-4942(2010)01-0005-05Research

on Propagation in Vitro of Quince

WEI Guo-qin1，2，DAI Hong-yi1*，SUN Yu-gang2，LIANG Mei-xia1，AN Miao2

(1.College of Horticulture， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China;

2.Shandong Institute of Pomology，Taian 271000，China)

Abstract The regeneration system in vitro of quince (Cydonia oblonga Mill.) was established. The results indicated that the optimal medium for calli induction via leaves was 1/2MS+KT 0.5 mg/L+ 2，4-D 1.0 mg/L+sucrose 30.0 g/L+agar 6.5 g/L. The optimal medium for the differentiation of calli was 1/2MS+TDZ 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L + sucrose 30.0 g/L+agar 6.5 g/L. The optimal medium for plant regeneration via leaves was MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 30.0 g/L+agar 6.5 g/L. The optimal medium for root induction was 1/2MS+IAA 0.3 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L.

Key words Quince; Callus induction; Plant regeneration; Root induction

榅桲(Cydonia oblonga Mill.)屬薔薇科、榅桲屬(cydonia)果樹，原產(chǎn)于伊朗、土耳其[1]。其果實營養(yǎng)豐富，具有特殊芳香味，是食品工業(yè)的重要原料。榅桲在歐洲被用作西洋梨的矮化砧木，如榅桲A、榅桲B和榅桲C[2]。榅桲還可用作藥材和觀賞樹木[3～4]。

目前國外對榅桲的研究較多，對其組織培養(yǎng)及離體再生方面的研究也較成熟[5～12]。國內(nèi)對榅桲的研究較少，僅局限于對植物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性、栽培管理、莖尖組織培養(yǎng)[13～14]及榅桲果實中一些成分的研究[3，4]，有關(guān)榅桲愈傷組織誘導(dǎo)及葉片再生培養(yǎng)的研究在國內(nèi)尚未見詳細(xì)報道。

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)于1991年從英國引進(jìn)榅桲A的種子，經(jīng)播種獲得少量植株。為了加速繁殖，我們對其進(jìn)行了組織培養(yǎng)快繁研究，并建立了榅桲的離體再生體系。1 材料與方法

1.1 材料

2009年4月份自田間取榅桲枝條，剝?nèi)⊙績?nèi)約0.5 mm大小的莖尖，用75%酒精表面消毒10~15 s、0.1% HgCl2滅菌4 min，經(jīng)蒸餾水沖洗5~6次后，接種于MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng)，30 d后將成活新梢莖段轉(zhuǎn)接至MS+6-BA 0.30 mg/L+IAA 0.03 mg/L+蔗糖30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基中繼代增殖，40 d后苗高4~5cm，以后每30 d繼代一次。試驗所用材料均取自榅桲繼代苗(圖版A)。

1.2 方法

1.2.1 葉片愈傷組織誘導(dǎo)

選取試管苗頂部3~4片新葉，用手術(shù)刀沿垂直于葉脈方向劃傷葉片，傷口間距約2 mm，分別接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在恒溫(26℃)暗環(huán)境下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。

1.2.2 愈傷組織不定芽分化 取生長較快的愈傷組織，接種于添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的MS培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)室中誘導(dǎo)分化不定芽。

1.2.3 葉片不定芽再生 選取試管苗頂部3~4片新葉，用手術(shù)刀沿垂直于葉脈方向切割，間距約1~2 mm，并保持葉片的完整性，分別將葉片接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并進(jìn)行不同時間的暗處理，30 d后觀察不定芽分化情況。

1.2.4 不定根的誘導(dǎo) 取生長健壯、高約3 cm的莖段接種于生根培養(yǎng)基中，40 d后統(tǒng)計生根情況。

1.2.5 培養(yǎng)條件 本試驗所用基本培養(yǎng)基有MS、3/4MS、1/2MS，其中蔗糖濃度30.0 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH 5.8，培養(yǎng)溫度26℃。光照培養(yǎng)時光照周期為16 h/d，光照強(qiáng)度為1 500~2 000 lx，暗培養(yǎng)采用黑暗恒溫(26℃)培養(yǎng)箱。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

將葉片接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C4~C7培養(yǎng)基中的葉片7 d后開始在切口處形成淺黃色愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的延長切口處的愈傷組織不斷增大，35 d左右葉片完全愈傷化。其余培養(yǎng)基中的葉片在接種10 d后開始形成愈傷組織，生長速度較慢。由表1可見，8種培養(yǎng)基均能高效誘導(dǎo)出愈傷組織。葉片在添加KT和2，4-D的培養(yǎng)基中出愈率均達(dá)100%，以在C5培養(yǎng)基中形成的愈傷組織體積最大，說明C5培養(yǎng)基最適合誘導(dǎo)榅桲愈傷組織。對比C2、C7培養(yǎng)基可以看出，2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織的效果優(yōu)于IBA。不同的植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)的愈傷形態(tài)不同:C1~C3培養(yǎng)基誘導(dǎo)出白色、堅硬、致密愈傷組織(圖版C)，繼代生長慢，有輕微褐變現(xiàn)象;C4~C7培養(yǎng)基誘導(dǎo)出淺黃色、松散愈傷組織(圖版B)，繼代增殖快，不褐變;C8培養(yǎng)基誘導(dǎo)出黃色、堅硬、致密愈傷組織，繼代生長較快，不褐變(圖版D)。3種形態(tài)的愈傷組織在原培養(yǎng)基上均無不定芽發(fā)生。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基植物生長調(diào)節(jié)劑濃度(mg/L)BAKTIBA2，4-D外植體數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)率(%)愈傷形成量

C11.0-0.5-4052.5 d多

C20.5-1.0-4087.5 ab多

C30.5-0.5-4085.0 bc多

C4-1.0-0.540100 a較多

C5-0.5-1.040100 a最多

C6-0.5-0.540100 a較多

C70.5--1.040100 a較多

C8-0.51.0-4077.5 cd較多

注:表內(nèi)同列不同小寫字母表示鄧肯新復(fù)極差法檢驗差異顯著(P<0.05)，下表同?；九囵B(yǎng)基為1/2MS。

2.2 愈傷組織分化不定芽

接種12 d后開始有不定芽生成，40 d 后不定芽長成1.0～1.5 cm長的新梢(圖版F)，當(dāng)不定芽高約1.5 cm時要及時轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中，否則會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。表2表明，適合榅桲愈傷

A.榅桲組培苗;B.淺黃色疏松愈傷組織;C.白色顆粒狀愈傷組織;D.黃色塊狀堅硬愈傷組織;E.愈傷分化成苗;F.葉片再生成苗;G.葉片在培養(yǎng)基E13中形成乳白色根;H.榅桲試管苗生根;I.榅桲移栽苗

榅桲離體培養(yǎng)繁殖圖版

表2不同植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷分化

不定芽的影響

培養(yǎng)基細(xì)胞分裂素(mg/L)NAA(mg/L)愈傷組織塊數(shù)產(chǎn)生芽點(diǎn)愈傷數(shù)產(chǎn)生不定芽愈傷數(shù)分化率(%)

D16-BA 1.00.130000 b

D26-BA 2.00.2301600 b

D36-BA 3.00.3301913.33 ab

D46-BA 4.00.4301226.67 ab

D5ZT 1.00.1302100 b

D6ZT 2.00.2302000 b

D7ZT 3.00.3303000 b

D8ZT 4.00.4301926.67 ab

D9TDZ 1.00.13022310.0 ab

D10TDZ 2.00.23030413.33 a

D11TDZ 3.00.33030516.67 a

D12TDZ 4.00.43030310.0 a

注:基本培養(yǎng)基為MS。

組織分化不定芽的培養(yǎng)基為MS+TDZ 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L。不同細(xì)胞分裂素對誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽的效果從大到小依次為:TDZ、6-BA、ZT。由D9、D10、D11、D12可知，當(dāng)TDZ與NAA的濃度配比為10時，愈傷組織分化不定芽的頻率隨著兩者濃度的提高先增大后減小。另外，多數(shù)愈傷組織在誘導(dǎo)不定芽過程中能產(chǎn)生綠色小芽點(diǎn)，但不定芽再生頻率低。

2.3 葉片不定芽分化

2.3.1 暗培養(yǎng)時間對葉片不定芽分化的影響 由表3可以看出，暗培養(yǎng)時間對榅桲葉片不定芽的分化有顯著影響。隨著暗培養(yǎng)時間的延長，榅桲葉片不定芽再生率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。無暗培養(yǎng)處理時，不定芽再生率為0;暗培養(yǎng)時間

表3 不同暗培養(yǎng)時間對榅桲離體葉片

再生不定芽的影響

暗培養(yǎng)時間 (d)接種數(shù)(個)開始分化時間(d)再生率(%)再生葉片平均再生芽數(shù)

032-0 c0 d

10321012.50 b3.03 b

2032828.13 a3.81 a

3032921.88 ab2.94 b

4032918.75 ab1.91 c

為20 d時，不定芽再生率和再生芽數(shù)均達(dá)到最高值，分別為28.13%和3.81個;隨著暗培養(yǎng)時間的進(jìn)一步延長，葉片不定芽再生率和再生芽數(shù)開始下降。不同的暗處理下，葉片開始分化的時間相差不大。

2.3.2 不同接種方式對葉片不定芽分化的影響

將葉片按正放、反放兩種不同的接種方式接種到MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30.0 g/L +瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)20 d后，置于光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。表4表明，正放時獲得的葉片再生率和平均再生芽數(shù)較高，兩種接種方式下的葉片再生率差異顯著，單葉片平均再生芽數(shù)差異不顯著。

表4 葉片接種方式對榅桲離體葉片

再生不定芽的影響

接種方式調(diào)查葉片數(shù)(個)再生率(%)再生芽數(shù)(個)

正放6528.29 a3.06 a

反放6513.75 b2.98 a

2.3.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片不定芽分化的影響

將葉片暗培養(yǎng)20 d后置于光下培養(yǎng)，10 d后即有不定芽發(fā)生。6-BA誘導(dǎo)的不定芽多為單芽，TDZ誘導(dǎo)的不定芽多為簇生芽。表5表明，各種處理對榅桲葉片不定芽誘導(dǎo)的頻率均較低，且單葉片平均再生芽數(shù)均小于4.0。當(dāng)6-BA與

表5 植物生長調(diào)節(jié)劑對榅桲葉片再生的影響

培養(yǎng)基細(xì)胞分裂素(mg/L)NAA(mg/L)再生率(%)平均再生芽數(shù)(個) 葉片切口狀態(tài)

E16-BA 1.00.10 c0少量綠色愈傷組織、堅硬致密

E26-BA 2.00.24.76 c2.0綠色愈傷組織、堅硬致密，再生芽細(xì)弱不經(jīng)愈傷，為單芽

E36-BA 3.00.35.13 c2.5綠色愈傷組織、致密堅硬，再生芽為單芽

E46-BA 3.00.017.5 bc1.33綠色愈傷組織、致密堅硬，有白色顆粒狀芽點(diǎn)，再生芽不經(jīng)愈傷

E56-BA 4.00.44.65 c1.0綠色愈傷組織、堅硬致密，再生芽有玻璃化現(xiàn)象

E66-BA 6.00.60 c0綠色愈傷組織且玻璃化

E76-BA 8.00.80 c0綠色愈傷組織且玻璃化

E86-BA 10.01.00 c0綠色愈傷組織且玻璃化

E9TDZ 1.00.116.32 ab2.13再生苗經(jīng)愈傷，簇生，生長健壯

E10TDZ 2.00.124.00 a3.31再生苗經(jīng)愈傷，簇生，生長健壯

E11TDZ 2.00.220.00 a2.9再生苗經(jīng)愈傷，簇生，生長健壯

E12TDZ 3.00.322.22 a2.22再生苗經(jīng)愈傷，簇生，生長健壯

E13ZT 3.00.30 c0無愈傷組織形成，有少量根發(fā)生

注:基本培養(yǎng)基為MS。

NAA的濃度配比為10∶1時，隨著兩者濃度的提高葉片再生率呈先增大后減小趨勢，當(dāng)6-BA濃度大于6.0 mg/L時，再生率為0，高濃度的6-BA和ZT誘導(dǎo)出的再生芽均有玻璃化現(xiàn)象。由E3、E12、E13知，TDZ誘導(dǎo)葉片再生的效果顯著優(yōu)于6-BA和ZT。使用ZT的培養(yǎng)基E13誘導(dǎo)出少量不定根(圖版E)。培養(yǎng)基E10誘導(dǎo)的不定芽最多，長勢最好(圖版G)。另外，本試驗對不定芽在葉片上的再生位置進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果顯示9.68%的不定芽再生于葉尖部，29.03%的不定芽再生于葉中部，61.29%的不定芽再生于葉柄部。

2.4 生根誘導(dǎo)

莖段接種20 d后開始有乳白色根發(fā)生，40 d后根長4~5 cm(圖版H)，莖段在1/2MS培養(yǎng)基中生根較早。由表6可見，培養(yǎng)基為1/2MS時，單獨(dú)使用NAA，生根率隨著NAA濃度的增加而增加;單獨(dú)使用IAA，生根率隨著IAA濃度的增加而降低。對比F2、F4、F5知，NAA的濃度固定為0.6 mg/L時，莖段在1/2MS中的生根率顯著大于在3/4MS和MS培養(yǎng)基中的生根率;對比F7、F9、F10知，IAA的濃度固定為0.6 mg/L時，莖段在1/2MS中的生根率也大于在3/4MS和MS培養(yǎng)基中的生根率。由此可見，1/2MS比3/4MS和MS培養(yǎng)基更適合誘導(dǎo)生根，過量的無機(jī)鹽不利于生根。雖然1.2 mg/L的NAA也能高效地誘導(dǎo)出不定根，但是NAA誘導(dǎo)的根部產(chǎn)生大量愈傷組織，不利于小苗移栽成活，可見IAA比NAA更適合榅桲誘導(dǎo)生根。由表6可知，適合榅桲生根的最佳培養(yǎng)基是1/2MS + IAA 0.3 mg/L。

表6培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑對

誘導(dǎo)生根的影響

處理培養(yǎng)基NAA(mg/L)IAA(mg/L)接種株數(shù)生根株數(shù)生根率(%)平均生根數(shù)(條)

F11/2MS0.3-4536.67 d4.23

F21/2MS0.6-452657.78 a6.08

F31/2MS1.2-452862.22 a6.50

F43/4MS0.6-451226.67 bc7.83

F5MS0.6-451431.11 bc2.57

F61/2MS-0.3452964.44 a4.50

F71/2MS-0.6452146.67 ab1.86

F81/2MS-1.2451328.89 bc3.30

F93/4MS-0.6451431.11 bc2.11

F10MS-0.645613.33 cd1.67

2.5 生根苗的移栽

選取生長健壯，高4~5 cm，帶根較多的幼苗進(jìn)行移栽，移栽前先煉苗3~4 d，然后將根部的培養(yǎng)基用無菌水沖洗干凈，移栽到已滅菌的蛭石基質(zhì)中，遮蔭，防風(fēng)，相對濕度保持在80%左右，移栽成活率可達(dá)80%以上(圖版I)。

3 討論與結(jié)論

3.1 榅桲組織培養(yǎng)過程中不發(fā)生褐變，但容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，導(dǎo)致增殖系數(shù)明顯降低，這是榅桲組織培養(yǎng)中迫切需要解決的問題。本試驗培養(yǎng)基中6-BA濃度越高試管苗玻璃化現(xiàn)象越嚴(yán)重。在同一培養(yǎng)基中，隨著繼代次數(shù)的增加試管苗玻璃化程度也增大，這可能是由于6-BA在組培苗體內(nèi)積累效應(yīng)的影響，可見榅桲的玻璃化現(xiàn)象與6-BA的濃度有密切的關(guān)系。此外培養(yǎng)室的溫度太高[15]、光照太強(qiáng)、光照時間過長也容易導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。據(jù)報道，培養(yǎng)基中氮素形態(tài)[16]、瓊脂用量、蔗糖濃度、pH值、活性炭添加與否也對玻璃化現(xiàn)象有重要影響[17，18]。

3.2 本試驗獲得的榅桲葉片再生率比較低，僅為24%。Ramon Dolcet-Sanjuan等(2006)[5]獲得的榅桲葉片再生率達(dá)78%，Barton S.Baker等(1993)[7]獲得的榅桲葉片再生率達(dá)85%，可見本試驗結(jié)果與國外還存在較大差距，需要進(jìn)一步探索影響榅桲葉片再生的因素，尋找適合榅桲葉片再生的條件，提高其再生率。另外取材環(huán)境的差異也會對葉片再生效果產(chǎn)生一定的影響。

3.3 本試驗共采用3種方式對榅桲進(jìn)行離體擴(kuò)大繁殖:(1)莖段繼代繁殖直接獲取大量叢生新梢，然后誘導(dǎo)不定根得到大量完整植株;(2)先由葉片誘導(dǎo)愈傷組織，再由愈傷組織誘導(dǎo)不定芽獲得叢生新梢，最后誘導(dǎo)不定根獲得完整植株;(3)直接將葉片接種到誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基上，獲得叢生新梢，然后誘導(dǎo)不定根獲得完整植株。第1種方法簡單易行，短時間內(nèi)可獲得大量整齊一致的植株，不易發(fā)生變異，繁殖速度較快。第2種方法植株繁殖速度較慢，由于植株再生過程中經(jīng)過了愈傷階段，再生植株無性系變異較大，嵌合體比例高[19];第3種方法建立的植株再生系統(tǒng)是遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的受體體系，是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)方面有重要意義[18]。

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