摘 要:本試驗(yàn)初步研究了植物內(nèi)生真菌球毛殼(Chaetomium globosum)ND35抗生物質(zhì)粗提物對(duì)植物生長(zhǎng)性狀和植物根際土壤微生物的影響，對(duì)小白鼠、大白兔的毒性，子囊孢子在水中的存活及對(duì)魚(yú)類的安全性。結(jié)果表明，球毛殼ND35抗生物質(zhì)粗提物對(duì)黃瓜、菜豆和小麥的種子是安全的，并且能夠顯著增加須根數(shù)和根鮮重，促進(jìn)種苗生長(zhǎng)，對(duì)根際菌群數(shù)量無(wú)顯著影響，對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)屬低毒級(jí);球毛殼ND35子囊孢子在水中能自行消解，且低于105cfu/ml時(shí)為泥鰍生長(zhǎng)無(wú)顯著影響;表明球毛殼菌ND35無(wú)毒、無(wú)污染，用于土傳病害的生物防治無(wú)明顯性風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞:植物內(nèi)生真菌;球毛殼ND35;子囊孢子;生物安全性

中圖分類號(hào):S476+.19文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2010)01-0071-05

Evaluation on Biological Security of Endophytic Fungus Chaetomium globosum ND35

GAO Jian-feng1， LI Xue1， LIU Shan-shan1， KONG Dan-dan1， ZHUANG Zhen-guo1， GAO Ke-xiang1*， LIU Yong-hong2

(1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018，China; 2.Demonstration Forestry Farm of Hebei Province， Yixian 074200，China)

Abstract The survival of the ascospores of Chaetomium globosum ND35 in water and its security to loach， and the effects of the crude extract of antibiotics from C. globosum ND35 on the rhizosphere microorganisms and growth of plant， as well as its toxicity to white mice and rabbits were studied in this experiment. The results showed that the crude extract was safe for cucumber， bean and wheat seeds， could significantly increase the number of fibrous roots and the fresh weight of radicle and promote the growth of seedlings; it had no significant impact on the number of the rhizosphere microorganisms， and it had low toxicity to animals. The ascospores could be digested spontaneously in the water， and when lower than 105 cfu/ml， it had no significant influence on loach. Therefore， C. globosum ND35 was non-toxic and non-polluting， and had no significant risk for biological control of soil-borne diseases.

Key words Endophytic fungus; Chaetomium globosum ND35; Ascospore; Biological security

毛殼菌(Chaetomium spp.)作為一類具有重要生防價(jià)值的生防菌，以其作用機(jī)制多樣性及防治病害的廣譜性而越來(lái)越受到關(guān)注[1，2]。球毛殼(Chaetomium globosum) ND35是一株分離自健康楊樹(shù)的內(nèi)生真菌，具有廣譜的拮抗活性[3]。球毛殼ND35抗生素在植物病害生物防治中起重要作用，其抗生素的產(chǎn)生、提取純化及其在離體和溫室條件下的抑菌防病作用已有報(bào)道[4]。

球毛殼ND35作為活細(xì)胞制劑，以其對(duì)環(huán)境影響小以及在作用方式上不易使病原菌產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)而得到認(rèn)可，但大量球毛殼ND35施用后其安全性如何，球毛殼ND35作為生防菌施用后是否無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)殘留，對(duì)環(huán)境中其它有益微生物的影響如何，尚未見(jiàn)報(bào)道。 

本研究的目的在于通過(guò)對(duì)球毛殼ND35生物防治過(guò)程中可能遇到的對(duì)宿主作物生長(zhǎng)的影響，對(duì)根際土壤中其它有益微生物的影響，對(duì)水資源安全性、魚(yú)苗生長(zhǎng)等生態(tài)因子的影響以及對(duì)小白鼠、大白兔的毒性試驗(yàn)，明確球毛殼ND35的生物安全性，以期為今后球毛殼ND35在生物防治中的安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試生防菌球毛殼 (Chaetomium globosum) ND35及其抗生物質(zhì)粗提物均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系提供;供試菜豆品種為長(zhǎng)白7號(hào)，番茄品種為新紅寶，黃瓜品種為津春4號(hào)，小麥品種為中優(yōu)9507。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 球毛殼菌ND35對(duì)寄主植物主要生育性狀的影響?yīng)ⅫS瓜、菜豆和小麥種子用75%乙醇消毒30 s，放入1 mg/ml的球毛殼ND35粗提液浸泡1 h，于28℃室溫下催芽，以無(wú)菌水浸泡 1 h的種子作對(duì)照，待種子“露白”后播于滅菌的營(yíng)養(yǎng)土里，每盆3株，同時(shí)用1 mg/ml的球毛殼ND35粗提液灌根處理，每盆20 ml。以無(wú)菌水灌根作對(duì)照，重復(fù)3次，待幼苗生長(zhǎng)2周后，拔出植株，流水沖掉根部土壤，測(cè)量植株的生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.2.2 球毛殼菌ND35對(duì)土壤中主要微生物類群的影響?yīng)?/p>

精選飽滿且大小均一的菜豆、黃瓜和番茄種子，經(jīng)溫湯催芽后播種于裝有田間營(yíng)養(yǎng)土的花盆內(nèi)，用1 mg/ml球毛殼菌ND35粗提液進(jìn)行灌根處理，設(shè)空白對(duì)照，每處理重復(fù)3次。播種后30天，分別取菜豆、黃瓜和番茄根際土壤，稀釋105、104、103倍，分別吸取1 ml涂抹在NA、加入硫酸鏈霉素的PDA及高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上，26～29℃培養(yǎng)3～5天，調(diào)查菌落數(shù)。

1.2.3 球毛殼菌ND35子囊孢子在水中的活性和降解

分別取泰安市泰山區(qū)渿河水、泰山龍?zhí)端畮?kù)水、泰安郊區(qū)大津口水庫(kù)水及自來(lái)水各200 ml，放入三角瓶中，分別加入球毛殼ND35子囊孢子，使水中子囊孢子的濃度為106 cfu/ml，每處理重復(fù)3次。在26℃下于往復(fù)式搖床上緩慢振動(dòng)培養(yǎng)，每隔3天取樣一次，在光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)子囊孢子的存活數(shù)。

1.2.4 球毛殼菌ND35對(duì)魚(yú)類的安全性試驗(yàn)將事先存放1天的自來(lái)水，分別接種球毛殼菌ND35子囊孢子，使水中的孢子濃度分別為105 cfu/ml和106 cfu/ml，每盆加入6～7 cm長(zhǎng)的泥鰍20條，以清水為對(duì)照，每3天換水一次，24～26℃室溫下培養(yǎng)，以20天為一個(gè)生長(zhǎng)周期，2天后開(kāi)始記錄魚(yú)苗死亡數(shù)，之后定期進(jìn)行觀察并做好記錄。

1.2.5 球毛殼菌ND35抗生物質(zhì)粗提物的毒性檢測(cè)試驗(yàn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn):以急性毒性試驗(yàn)公認(rèn)的首選動(dòng)物小白鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，以球毛殼菌ND35的抗生物質(zhì)粗提物為試驗(yàn)樣品，按Hom氏方法設(shè)計(jì)了20、40 mg/只的劑量，每處理雌雄各2只。將合適劑量的樣品與饅頭屑混合，給藥前供試動(dòng)物絕食16 h，雌雄動(dòng)物分別進(jìn)行，染毒后持續(xù)觀察14天，記錄動(dòng)物中毒癥狀和死亡時(shí)間(小白鼠平均每只體重20 g)。急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn):以大白兔為試驗(yàn)動(dòng)物，以球毛殼菌ND35的抗生物質(zhì)粗提物為試驗(yàn)樣品，按Hom氏方法設(shè)計(jì)了20、40 mg/只的劑量，每處理雌雄各1只，染毒方法為在動(dòng)物背部用電推去除背毛，形成面積約5 cm×6 cm的脫毛區(qū)，將所設(shè)劑量的樣品均勻涂于4 cm×5 cm的紗布上，然后貼于脫毛區(qū)的皮膚上，外面覆蓋一層聚乙烯薄膜，用膠布固定。4 h后去掉覆蓋物，以溫水洗凈藥物，染毒后持續(xù)觀察14天，記錄動(dòng)物中毒癥狀和死亡時(shí)間。

兔眼單次刺激試驗(yàn):大白兔雌雄各2只，以球毛殼菌ND35的抗生物質(zhì)粗提物為試驗(yàn)樣品，染毒方式為輕拉動(dòng)物左眼眼瞼，將20、40 mg樣品分別倒入一只大白兔結(jié)膜囊內(nèi)，輕輕閉合眼瞼約1 min，以動(dòng)物自身對(duì)側(cè)右眼為對(duì)照，給藥后持續(xù)觀察14天進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 球毛殼菌ND35對(duì)宿主植物主要生育性狀的影響?yīng)?/p>

試驗(yàn)結(jié)果表明，1 mg/ml的球毛殼菌ND35抗生物質(zhì)的粗提液對(duì)雙子葉的黃瓜、菜豆和單子葉的小麥種子的萌發(fā)沒(méi)有抑制作用;對(duì)胚根生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，可使根鮮重增加，且有促進(jìn)根生長(zhǎng)的作用，能使須根數(shù)增多;對(duì)黃瓜株高等地上部生長(zhǎng)性狀也有明顯促進(jìn)作用，黃瓜幼苗健康無(wú)病，葉片大、葉色綠(表1和 圖1)。

表1 球毛殼菌ND35粗提液對(duì)植物的促生長(zhǎng)作用

植物種類根長(zhǎng)(cm)地上部莖高(cm)莖和葉重量(g/株)根重(g/株)須根數(shù)(個(gè))

黃瓜 對(duì)照9.20±3.0516.33±2.561.24±0.310.05±0.029.94±2.27

黃瓜 處理11.37±4.6815.45±1.651.32±0.380.06±0.0112.56±3.27

菜豆 對(duì)照22.15±3.4145.41±7.293.74±0.301.04±0.619.83±1.20

菜豆 處理22.56±3.9455.91±10.921.84±0.963.41±0.419.63±1.36

小麥 對(duì)照17.42±7.9136.18±0.893.36±0.450.11±0.065.13±0.04

小麥 處理16.86±5.135.56±0.513.97±0.370.07±0.015.44±0.03

A1、B1分別是用球毛殼菌ND35抗生物質(zhì)粗提取液

處理的菜豆、黃瓜;A2、B2分別是用清水處理的菜豆、黃瓜

圖1 球毛殼菌ND35抗生物質(zhì)粗提液 對(duì)植物的促生長(zhǎng)作用

2.2 球毛殼菌ND35對(duì)土壤中主要微生物類群的影響?yīng)?/p>

球毛殼ND35活菌制劑對(duì)番茄、黃瓜和菜豆根際土壤真菌總量的增加有一定作用，但與對(duì)照相比差異不顯著;球毛殼菌ND35活菌劑對(duì)番茄和菜豆根際土壤細(xì)菌的總量基本無(wú)影響，對(duì)黃瓜根際土壤細(xì)菌總量的增加有一定作用，而有益細(xì)菌含量的提高對(duì)改善土壤的理化性狀，提高土壤肥力具有重要意義;球毛殼ND35活菌劑對(duì)番茄和菜豆根際土壤放線菌的總量有一定抑制作用，但與對(duì)照相比差異不顯著;而球毛殼ND35活菌劑在高濃度時(shí)對(duì)黃瓜根際土壤放線菌的總量有一定抑制作用，可能是球毛殼ND35活菌制劑中加入了對(duì)土壤放線菌的抑制性微量元素有關(guān)(表2)。

2.3 球毛殼菌ND35對(duì)水資源安全性的影響?yīng)?/p>

試驗(yàn)結(jié)果表明:球毛殼菌ND35子囊孢子在河水、水庫(kù)水及自來(lái)水中均不能萌發(fā)，接菌后1天，各類水中的子囊孢子數(shù)量之間差異不顯著，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，存活孢子量有所差異。其中自來(lái)水中存活的孢子量與其它水中相比差異顯著，存活時(shí)間也較長(zhǎng)，河水中的存活時(shí)間最短，子囊孢子在接菌后第3天數(shù)量開(kāi)始下降，第14天即檢測(cè)不到子囊孢子，其降解速度依次為河水>水庫(kù)水>自來(lái)水。子囊孢子在各種水中不能萌發(fā)，在河水中的降解速度最快，子囊孢子自行消解，因

表2球毛殼菌ND35對(duì)番茄等根際土壤中主要微生物類群的影響(菌落:個(gè))

種類稀釋對(duì)照真菌處理真菌對(duì)照細(xì)菌處理細(xì)菌對(duì)照放線菌處理放線菌

番茄1230.33±0.051.67±0.657.67±1.511.00±0.535.00±0.266.67±2.085.33±1.5299±24.84265.33±12.856.67±0.5730.33±4.04260.23±9.64002.33±0.63004.33±1.51

黃瓜1232.00±1.002.67±1.153.33±1.071.00±0.786.67±2.0310.66±0.1917.33±4.3488.00±14.44217.33±41.9133.67±4.5097.33±13.22388.00±24.331.00±0.444.67±1.764.00±1.3200.55±0.230.33±0.12

菜豆12319.33±4.0419.00±4.7830.67±12.1226.33±3.7529.67±5.7641.00±5.5864.33±10.2190.67±11.08103.67±24.3178.00±4.0586.33±8.6489.00±6.9145.33±10.5340.33±10.7456.00±8.3245.00±14.1349.33±12.1553.67±8.07

注:1、2、3分別代表根際土壤被稀釋了105倍，104倍和103倍。

此不會(huì)造成水污染(圖2)。

2.4 球毛殼菌ND35對(duì)泥鰍安全性的影響?yīng)?/p>

試驗(yàn)結(jié)果表明:球毛殼菌ND35兩個(gè)濃度處理及對(duì)照均在室內(nèi)飼養(yǎng)第3天達(dá)到死亡高峰，可能是泥鰍對(duì)新的生長(zhǎng)環(huán)境不適應(yīng)的一種反應(yīng)。隨

后幾天死亡率進(jìn)入平穩(wěn)期，表現(xiàn)為無(wú)規(guī)律的零星自然死亡。處理20天的結(jié)果顯示，105 cfu/ml球毛殼菌ND35孢子懸浮液對(duì)泥鰍的存活率無(wú)顯著差異，且在此濃度下泥鰍長(zhǎng)勢(shì)良好，體長(zhǎng)較對(duì)照長(zhǎng)，體色較對(duì)照黑。但是在106 cfu/ml球毛殼菌ND35孢子懸浮液中泥鰍全部死亡，即在106 cfu/ml或更高濃度下對(duì)泥鰍不安全(表3)。

2.5 球毛殼菌ND35的毒性檢測(cè)結(jié)果

小白鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明:所有動(dòng)物染毒后無(wú)明顯中毒癥狀，亦未出現(xiàn)死亡，半致死劑量(LD50)雄性和雌性小白鼠均大于2 000 mg/kg，表明球毛殼菌ND35急性經(jīng)口毒性為“低毒”級(jí)。

圖2 球毛殼菌ND35的子囊孢子在水中的降解

表3 球毛殼菌ND35的孢子對(duì)泥鰍存活率的影響

處理天數(shù)存活率(%)

清水對(duì)照105cfu/ml孢子懸浮液

12020

31818

61817

91816

121716

151716

急性皮膚單次刺激試驗(yàn)結(jié)果表明:動(dòng)物皮膚連續(xù)刺激14天積分為0，表明球毛殼菌ND35對(duì)兔皮膚單次刺激強(qiáng)度為“無(wú)刺激性”;急性兔眼單次刺激試驗(yàn)結(jié)果表明:所有動(dòng)物給藥后1 h 均未出現(xiàn)結(jié)膜沖血及水腫，眼連續(xù)刺激14天積分為0，表明球毛殼菌ND35對(duì)兔眼刺激強(qiáng)度分級(jí)為“無(wú)刺激性”。

3 討論與結(jié)論

由于過(guò)度使用化學(xué)農(nóng)藥引起了一系列環(huán)境與社會(huì)問(wèn)題，使用農(nóng)用抗生素代替化學(xué)農(nóng)藥防治植物病害是今后發(fā)展的方向之一[5]。所以農(nóng)用抗生素的生物安全性問(wèn)題也顯得尤為重要，生物安全性問(wèn)題也是球毛殼ND35作為微生物農(nóng)藥在研究和使用過(guò)程中不能回避的問(wèn)題。一種微生物通過(guò)人為接種的方式被引入土壤中，可能通過(guò)對(duì)生態(tài)位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)及空間的競(jìng)爭(zhēng)使一種甚至多種土壤中自然存在的微生物減少，從而破壞了土壤中原有的微生態(tài)環(huán)境。莊敬華等(2006)[6]對(duì)木霉菌(Trichoderma sp.)的生物安全性進(jìn)行了檢測(cè)，試驗(yàn)表明，與其它微生物農(nóng)藥一樣木霉菌無(wú)毒、無(wú)污染，用于作物土傳病害的生物防治無(wú)明顯性風(fēng)險(xiǎn)。劉家發(fā)等(1999)[7]曾對(duì)幾種主要微生物農(nóng)藥品種蘇云金桿菌、增產(chǎn)菌、白僵菌及幾種多角體病毒進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明所試微生物農(nóng)藥是安全的，無(wú)毒、無(wú)污染。單純的微生物農(nóng)藥沒(méi)有急、慢性毒性。

毛殼菌應(yīng)用在果樹(shù)蔬菜生產(chǎn)中防治各種真菌病害已有報(bào)道[8，9]，但其對(duì)宿主植物和周圍環(huán)境的影響報(bào)道不多。本試驗(yàn)對(duì)分離自健康植物的內(nèi)生真菌球毛殼菌ND35進(jìn)行了生物安全性的初步評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果表明:球毛殼ND35對(duì)黃瓜、菜豆和小麥種子萌發(fā)、出苗沒(méi)有影響，對(duì)黃瓜、菜豆和小麥根系生長(zhǎng)和株高還有明顯的促進(jìn)作用;球毛殼ND35對(duì)番茄、黃瓜和菜豆根際的真菌、細(xì)菌及放線菌等微生物的正常生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響;球毛殼ND35子囊孢子在河水、水庫(kù)水及自來(lái)水中均不能萌發(fā)，且子囊孢子經(jīng)14～20天，菌體自行消解，當(dāng)濃度小于或等于105 cfu/ml的球毛殼ND35孢子進(jìn)入河水中，不會(huì)對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)造成影響;球毛殼ND35孢子制劑對(duì)小白鼠急性經(jīng)口毒性屬于“低毒”級(jí);急性經(jīng)皮膚單次刺激試驗(yàn)和經(jīng)兔眼單次刺激試驗(yàn)結(jié)果均表明為“無(wú)刺激性”?？梢酝茢啵蛎珰D35作為活體微生物制劑，與其它微生物農(nóng)藥一樣無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)殘毒，不傷害土壤中其它有益微生物，不影響土壤和環(huán)境中微生態(tài)循環(huán)，用于設(shè)施蔬菜及陸地等作物土傳病害的生物防治無(wú)明顯性風(fēng)險(xiǎn)。這為今后將球毛殼ND35菌株開(kāi)發(fā)成為實(shí)用的生防產(chǎn)品，深入研究其生物安全性和投放環(huán)境后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定了基礎(chǔ)。

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