摘 要:采用PCR法克隆了洋蔥的花青素合成酶基因AcANS，并對其進(jìn)行序列比對和生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，其開放閱讀框為1 059 bp，編碼352個氨基酸殘基;具有一個富含AT的內(nèi)含子，符合GT-AG規(guī)則;其蛋白質(zhì)第210～309肽段含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的結(jié)構(gòu)域。

關(guān)鍵詞:洋蔥;花青素合成酶基因;基因克隆;序列分析

中圖分類號:Q785文獻(xiàn)標(biāo)識號:A文章編號:1001-4942(2010)01-0001-05

Cloning and Sequence Analysis of Anthocyanidin Synthase Gene in Onion

MIAO Jun， LIU Bing-jiang， YANG Yan-yan， HUO Yu-meng，ZHANG Yi-hui，HUO Feng-mei，XIU Jing-run，WU Xiong*

(Institute of Vegetables， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China)

Abstract Bulb color is an important economic trait in onion (Allium cepa). The anthocyanidin synthase gene AcANS in onion was cloned by PCR， and its sequence alignment and bioinformatics analysis were carried out. The open reading frame(ORF) of AcANS gene was 1 059 bp， and it encoded a protein with 352 amino acids. An AT-rich intron of 107 bp， obeying the GT-AG rule， was in the DNA sequence. The 2OG-Fe (II) domain of oxygenase family gene was in the peptide from 210 to 309.

Key words Onion;Anthocyanidin synthase gene; Gene clone; Sequence analysis

洋蔥(Allium cepa L.)以肥大的肉質(zhì)鱗莖為食用器官，根據(jù)其鱗莖的皮色可分為紅皮、黃皮和白皮等品種。皮色是洋蔥的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，具有其自身的遺傳規(guī)律[1，2]。器官的顏色是植物最重要、最直觀的表型之一，對其遺傳規(guī)律的研究起始于孟德爾對豌豆花色的研究，當(dāng)時的研究是將基因位點與易于觀察的色彩變異聯(lián)系起來。如今有關(guān)花[3～5]、玉米籽粒[6～8]和擬南芥種皮[9，10]的顏色等，在遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究已取得重要進(jìn)展。

花青素是決定花、葉片、果實和種子等顏色的重要因素之一，屬類黃酮(flavonoids)物質(zhì)。類黃酮化合物是植物的次生代謝產(chǎn)物，其基本碳骨架結(jié)構(gòu)為C6-C3-C6，C3部分與O形成吡喃雜環(huán)。類黃酮化合物因其結(jié)構(gòu)差異可被分為6 種主要類型，包括查耳酮(chalcones)、黃酮(flavones)、黃酮醇(flavonols)、黃烷雙醇(flavandiols)、花色素苷(anthocyanins)和縮合單寧(condensed tannins 或proanthocyanidins)[11～13]。類黃酮廣泛分布于植物界且在植物體內(nèi)具有重要生理學(xué)意義，現(xiàn)已知它們控制著生長素的運(yùn)輸、根系的發(fā)育分支和向重性、種子萌發(fā)、紫外保護(hù)和抵御等[9，10，14]。

花青素由一系列酶催化合成，經(jīng)由苯基丙酸類合成路徑(phenylpropanoid pathway)和類黃酮生物合成途徑(flavonoids biosynthetic pathway)生成[11～13]。生物合成前體為丙二酰CoA 和對香豆酰CoA，由苯基乙烯酮合成酶(CHS)催化二者形成苯基乙烯酮。黃色苯基乙烯酮異構(gòu)化形成無色的黃烷酮。在黃烷酮羥基化酶(F3H)催化下形成無色的二羥基黃酮醇，由二羥基黃酮醇還原酶(DFR)催化還原形成無色花色素，無色花色素在花青素合成酶(ANS)作用下轉(zhuǎn)變成有色花色素。然后由UF3GT(UDP-葡萄糖類黃酮-3-氧-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶)催化，糖基化形成比較穩(wěn)定的花青素。本文克隆了洋蔥的花青素合成酶基因，并對其進(jìn)行序列比對和生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步探索洋蔥不同皮色的形成原因和分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及DNA、RNA提取

以洋蔥(Allium cepa L.)的新鮮葉片和花為材料，采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆??；蚪M總DNA用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，用pH 8.0 的TE 稀釋成50 ng/μl?？俁NA用RNAsimple總RNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，cDNA 第一鏈的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen，北京)完成。

1.2 PCR反應(yīng)及目的片段的克隆

本研究所用的上游引物P1:CGGGACAACATAACTCAGAACAATT和下游引物P2: CATAATCAAACATCAGAGTCATCC由博尚生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為25 μl，其中模板(基因組總DNA或cDNA)1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，引物各0.5 μl，10×Ex-Taq buffer 2.5 μl，Ex-Taq DNA polymerase(Takara，大連)0.13 μl，用滅菌蒸餾水補(bǔ)充至25 μl。

擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，58℃退火 1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72℃保溫7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Fluor ChemTM5500凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech， USA)上檢測并照相記錄，分子量Marker DL2000從大到小依次為:2000、1000、750、500、250和100 bp。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(Tiangen，北京)進(jìn)行回收，與克隆載體pMD18-T(Takara，大連)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆送到博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3 序列分析

利用Blast進(jìn)行序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)，主要采用DNAMAN 軟件及http://www.expasy.org和http://www.softberry.com等網(wǎng)上軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥AcANS基因的克隆

洋蔥總DNA擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物和RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分離(圖1)，再通過回收、連接、轉(zhuǎn)化后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果顯示總DNA擴(kuò)增片段1 215 bp，RT-PCR 產(chǎn)物1 108 bp，將其序列進(jìn)行ORF分析，發(fā)現(xiàn)有完整的開放讀碼框。其ORF序列1 059 bp，預(yù)測的蛋白質(zhì)由352個氨基酸殘基組成，將其命名為AcANS基因。

1.gDNA為模板 2.cDNA為模板 M.Marker DL2000

圖1 洋蔥AcANS基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 洋蔥AcANS基因的序列特征

將AcANS基因的基因組序列和cDNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)有一個107 bp的內(nèi)含子(圖2)。這一內(nèi)含子符合GT-AG規(guī)則，即其5′端為GT核苷酸殘基，而3′端為AG核苷酸殘基。并且內(nèi)含子區(qū)富含AT，其中A和T共 85個，G和C共 22個，AT含量高達(dá)79.4%;而外顯子區(qū)的AT含量為53.1%。

AcANS的Blast P 分析結(jié)果表明，此蛋白第210～309肽段含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的結(jié)構(gòu)域(圖3)。ProtParam 程序預(yù)測，AcANS的氨基酸組成中Leu占最大比例，高達(dá)12.2%;

黑體部分顯示內(nèi)含子序列(符合GT-AG規(guī)則)

圖2 洋蔥AcANS基因編碼區(qū)的DNA序列

圖3 洋蔥AcANS的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶家族基因的結(jié)構(gòu)域

Glu第二，占到8.0%。Signal P 3.0 Server 檢測結(jié)果顯示AcANS不含信號肽序列，為非分泌蛋白。

洋蔥的AcANS與水稻的OsANS和擬南芥的AtANS蛋白序列比較(圖4)，顯示它們具有一些保守的區(qū)段，其中第210～309肽段很保守，與Blast P 分析結(jié)果一致，含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的結(jié)構(gòu)域。

2.3 洋蔥AcANS進(jìn)化分析

將洋蔥的AcANS與水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、紅掌(Anthurium andraeanum)、荷蘭鳶尾(Iris hollandica)、芥菜(Brassica juncea)、甘藍(lán)(Brassica oleracea var.

圖4 洋蔥的AcANS與水稻的OsANS和擬南芥的AtANS蛋白序列比較

capitata)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)和牽牛(Ipomoea nil)等的花青素合成酶進(jìn)行聚類分析，結(jié)果(圖5)單子葉植物和雙子葉植物各聚成一類。十字花科的甘藍(lán)、芥菜和擬南芥聚在一起;豆科的大豆和苜蓿聚在一起;洋蔥和鳶尾有較近的親緣關(guān)系，并且與禾本科的水稻、小麥和玉米聚在一起。這就提示我們在今后洋蔥的研究中，可以優(yōu)先借鑒其它單子葉植物的信息，同時參考雙子葉植物的相關(guān)信息。

圖5 植物ANS的系統(tǒng)進(jìn)化

3 討論與結(jié)論

本研究從洋蔥基因組DNA和cDNA分別擴(kuò)增了花青素合成酶基因(AcANS)，通過兩者的序列比較發(fā)現(xiàn)其含有一個內(nèi)含子，這一內(nèi)含子符合GT-AG規(guī)則。AcANS的開放閱讀框為1 059 bp，編碼352個氨基酸殘基，其蛋白質(zhì)第210～309肽段含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的結(jié)構(gòu)域?；ㄇ嗨睾铣擅?anthocyanidin synthase，ANS)是花青素合成后期的酶，也有人稱其為無色花青素雙加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX)，是一種2-酮戊二酸鐵依賴型雙加氧酶，催化從無色花青素到有色花青素的轉(zhuǎn)變，即催化無色翠雀素、無色矢車菊色素和無色天竺葵色素生成翠雀素、矢車菊色素和花葵素[15～17]。

花青素合成酶基因是決定植物器官顏色的關(guān)鍵因素之一。Rosati 等(1999)[4]從美國金鐘連翹(Forsythia intermedia)中克隆得到了ANS基因和其啟動子，并證明在花瓣中無花色素苷是由于缺少ANS基因的表達(dá)所至。Nakatsuka等(2005)[5]發(fā)現(xiàn)，ANS基因的突變是導(dǎo)致龍膽花變?yōu)榘咨闹匾?。?/p>

花青素合成酶只是類黃酮生物合成途徑中的一個環(huán)節(jié)，整個途徑由一系列酶催化完成;同時編碼這一系列酶的結(jié)構(gòu)基因又受調(diào)節(jié)基因的控制，調(diào)控其表達(dá)的強(qiáng)度和模式。隨著洋蔥類黃酮生物合成途徑的相關(guān)基因逐步被揭示，我們將從這些基因的等位變異中開發(fā)與皮色相關(guān)的分子標(biāo)記，并把這些標(biāo)記應(yīng)用于洋蔥的雜交育種實踐中，建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的洋蔥雜交育種體系。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] Clarke A E， Jones H A， Little T M. Inheritance of bulb color in the onion [J]. Genetics，1944，29(6):569-575.

[2] Patil B S，Pike L M，Yoo K S. Variation in the quercetin content in different colored onions(Allium cepa L.) [J].J. Amer. Soc. Hort.Sci.，1995，120(6):909-913.

[3] Martin C，Carpenter R，Sommer H，et al.Control of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus[J].Plant J.，1991，1:37-49.

[4] Rosati C，Cadic A，Duron M，et al.Molecular characterization of the anthocyanidin synthase gene in Forsythia intermedia reveals organ-specific expression during flower development[J]. Plant Sci.，1999，149:73-79.

[5] Nakatsuka T，Nishihara M，Mishiba K， et al. Two different mutations are involved in the formation of white-flowered gentian plants[J]. Plant Sci.，2005，169:949-958.

[6] Messen A，Hohmann S，Martin W，et al. The En/Spm transposable element of Zea mays contains splice sites at the termini generating a novel intron from a dSpm element in the A2 gene[J]. EMBO J.，1990，9:3051-3058.

[7] Weiss D，Vander L A H，Kroon J T M，et al. The petunia homologue of the Antirrhinum majus candi and Zea mays A2 flavonoid genes:homology to flavonone 3-hydroxylase and the ethylene forming enzyme[J] . Plant Mol. Biol.，1993，22:893-897.

[8] Lesnick M L，Chandler V L . Activation of the maize anthocyanin gene A2 is mediated by an element conserved in many anthocyanin promoters[J]. Plant Physiology，1998，117:437-445.

[9] Debeaujon I， Léon-Kloosterziel K M， Koornneef M. Influence of the testa on seed dormancy， germination， and longevity in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2000，122:403-413.

[10]Buer C S，Muday G K. The transparent testa4 mutation prevents flavonoid synthesis and alters auxin transport and the response of Arabidopsis roots to gravity and light[J]. The Plant Cell，2004，16:1191-1205.

[11]Rupert C，Wilmouth R，Jonathan J， et al. Structure and mechanism of anthocyanidin synthase from Arabidopsis thaliana[J].