摘 要:建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定禽蛋制品中三聚氰胺的方法。用2%乙酸溶液提取試樣中的三聚氰胺，提取液經(jīng)乙腈稀釋后，以超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定。三聚氰胺的最低檢測(cè)限為0.05 mg/kg，加標(biāo)回收率為89.4%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.35%～6.37%。

關(guān)鍵詞:超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜;禽蛋制品;三聚氰胺

中圖分類號(hào):O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2010)01-0090-04Determination of Melamine in Poultry Egg Products by UPLC-MS/MS

HU Mei，WANG Jun*，ZHANG Hui，ZHANG Xi-qi，ZHU Jian-hua

(Shandong Supervision Inspection Institute for Product Quality /

National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food， Jinan 250100， China)

Abstract A method for determination of melamine in poultry egg productsby UPLC-MS/MS was established. The sample was extracted with 2% acetic acid solution， diluted with acetonitrile， and then detected by UPLC-MS/MS. The detectable limit of melamine was 0.05 mg/kg. The recovery of melamine was 89.4%～98.3% with the RSD of 3.35%～6.37%.

Key words UPLC-MS/MS;Poultry egg products;Melamine

禽蛋制品包括咸鴨蛋、松花蛋等，作為我國傳統(tǒng)食品，由于味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，長(zhǎng)期以來受到廣大群眾的喜愛。三聚氰胺簡(jiǎn)稱三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料， 白色結(jié)晶粉末，無味，常用于生產(chǎn)塑料、膠水、阻燃劑和化肥。由于不法商販將三聚氰胺添加到禽類飼料中，通過禽類的代謝而殘留于禽蛋中。關(guān)于禽蛋中三聚氰胺的檢測(cè)方法，國內(nèi)外尚無相關(guān)的研究報(bào)道。目前報(bào)道的食品或飼料中三聚氰胺的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[1，2]、液質(zhì)聯(lián)用法[1，3，4]、氣質(zhì)聯(lián)用法[1，5]、酶聯(lián)免疫法[6]等，由于基質(zhì)復(fù)雜，均需經(jīng)過固相萃取凈化或衍生化，操作繁瑣。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，通過大量試驗(yàn)，探索了禽蛋制品中三聚氰胺的快速測(cè)定方法，確定了以酸性提取劑提取，乙腈沉淀蛋白，免固相萃取凈化，超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜定性、定量測(cè)定和確證的方法，應(yīng)用于大量樣品檢測(cè)，效果理想。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈:色譜純;冰乙酸:分析純;2.0%乙酸溶液;乙酸銨:LC-MS用添加劑;微孔濾膜:孔徑0.22 μm，有機(jī)相;三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品:純度為99.7%;三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取100.0 mg(精確到0.1 mg)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 ml 容量瓶中，加入50 ml水溶解，用乙腈定容至刻度，配制成濃度為1.0 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。

1.2 儀器 

ACQUITY UPLCTM -Waters Quattro Premier XE型超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源;分析天平:感量0.1 mg;均質(zhì)機(jī);漩渦混合器;低溫高速離心機(jī):4℃，10 000 r/min。

1.3 樣品制備

鮮蛋類取10枚，去殼打成均勻蛋液;松花蛋及熟制蛋類各取10枚，去殼充分?jǐn)囁?、混勻。分別置于可密封的潔凈容器中，編號(hào)，儲(chǔ)存于4℃冰箱中。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g試樣 (精確到0.01 g)置于50 ml離心管中，準(zhǔn)確加入2.0%乙酸溶液20 ml ，鮮蛋類樣品振搖、漩渦混合2 min，其它類樣品10 000 r/min 均質(zhì)2 min，4℃、10 000 r/min離心5 min。取出恢復(fù)至室溫備用。

準(zhǔn)確移取0.5 ml離心后提取液至10 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，充分混勻后靜置5 min，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后待測(cè)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 

精確量取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，分別添加到2.00 g空白試樣中，添加濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/kg，混勻后放置10 min。按照與試樣相同的步驟處理后待測(cè)。

1.6 操作條件

1.6.1 色譜操作條件 色譜柱ACQUITY UPLCTM BEH HILIC(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動(dòng)相:A相為乙腈，B相為10 mmol/L乙酸銨水溶液;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:5 μl;梯度洗脫條件見表1。

表1梯度洗脫條件

時(shí)間(min)流速(ml/min)A(%)B(%)

0.00.3096.04.0

3.50.3088.012.0

3.60.4040.060.0

6.50.4096.04.0

5.90.4096.04.0

6.00.3096.04.0

注:以上流速和流動(dòng)相比例變化均為線性變化。

1.6.2 質(zhì)譜操作條件 離子源:電噴霧離子源，正離子;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);電離電壓:3.2 kV;離子源溫度:110℃;霧化溫度:400℃;錐孔氣流速:50 L/h;霧化氣流速:600 L/h;碰撞室壓力:3.6×10-3mPa.

1.6.3 其它參數(shù) 三聚氰胺的保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量見表2，典型的質(zhì)量色譜圖見圖1。

表2三聚氰胺參考保留時(shí)間、定性定量 離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量

名稱保留時(shí)間(min)定性離子對(duì)(m/z)定量離子對(duì)(m/z)錐孔電壓(V)碰撞能量(eV)

三聚氰胺2.55127>85127>68127>85351625

圖1 空白基質(zhì)中添加0.5 mg/kg三聚氰胺的質(zhì)量色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜質(zhì)譜條件的選擇

三聚氰胺分子量為126.12，分子中含有3個(gè)氨基，極性很強(qiáng)，在普通的反相液相色譜柱上幾乎沒有保留，多在死時(shí)間處出峰，難以定性、定量測(cè)定。本文采用了Waters公司的ACQUITY UPLCTMBEH HILIC色譜柱，該色譜柱采用親水性填料，對(duì)三聚氰胺等強(qiáng)極性化合物有較強(qiáng)的保留;同時(shí)由于采用1.7 μm的小顆粒填料，分離能力和分析速度大為提高。比較了乙酸銨、甲酸分別作為流動(dòng)相添加劑的分離效果及對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，三聚氰胺的峰形不佳;以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，分離、峰形和靈敏度俱佳，最終決定采用該體系分離測(cè)定三聚氰胺。

將濃度為1.0 mg/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過流動(dòng)注射泵注入質(zhì)譜儀，調(diào)諧并優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)，確定以127>85、127>68為定性離子對(duì)，其中127>85為定量離子對(duì)。若測(cè)得的樣品溶液和相同基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的保留時(shí)間一致，且定性離子對(duì)的相對(duì)豐度偏差符合表3的規(guī)定，則可判定樣品中存在三聚氰胺。

表3 定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度50%20%～50%10%～20%≤10%

允許的相對(duì)偏差±20%±25%±30%±50%

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

在2008年出臺(tái)的測(cè)定乳制品中三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22388-2008)中，規(guī)定了液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法三種測(cè)定方法均需采用固相萃取凈化，以消除基質(zhì)中的雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾。本研究采用了免固相萃取的快速前處理方法，經(jīng)與固相萃取凈化的方法比較，定量結(jié)果無差異，但前處理時(shí)間縮短2/3，僅需15 min，且檢測(cè)成本大幅下降。雖然檢出限(0.05 mg/kg)略高于固相萃取凈化(0.01 mg/kg)的方法，但仍遠(yuǎn)低于目前國內(nèi)外食品中三聚氰胺的限量值(2.5 mg/kg)，可充分滿足各類檢測(cè)的要求。

考慮到三聚氰胺具有弱堿性，采用酸性提取劑有利于提高提取效率。比較了5種提取劑對(duì)鮮蛋和蛋制品中三聚氰胺的提取效果，分別為0.1 mol/L高氯酸溶液、0.1 mol/L鹽酸溶液、乙腈—0.1 mol/L鹽酸水溶液(1∶1)、2%甲酸溶液、2%乙酸溶液。結(jié)果表明，0.1 mol/L高氯酸溶液和0.1 mol/L鹽酸溶液用于提取鮮蛋中的三聚氰胺時(shí)，雖經(jīng)乙腈沉淀蛋白，樣液仍難以經(jīng)微孔濾膜過濾，易堵塞色譜柱;乙腈-水(1∶1)用于鮮蛋中三聚氰胺的提取時(shí)，蛋液凝固成膠狀，無法獲得澄清的提取液; 2%甲酸溶液和2%乙酸溶液用于各類樣品的前處理，效果較好，但考慮到甲酸的揮發(fā)性強(qiáng)于乙酸，最終決定采用2%乙酸溶液作為提取劑。樣品加入2.0%乙酸提取后，在低溫(4℃)下10 000 r/min離心5 min，可獲得較為澄清的提取液。

離心后的提取液中仍含有一定的蛋白質(zhì)，由于采用了1.7 μm的小顆粒填料色譜柱，如不去除，可能造成色譜柱堵塞;另外親水性的HILIC色譜柱適宜于采用較高比例的有機(jī)相(乙腈)作為流動(dòng)相，而提取液為100%水相，直接進(jìn)樣導(dǎo)致色譜峰形不好?？紤]到上述因素，測(cè)定時(shí)移取0.5 ml提取液，加入乙腈混勻并定容至10 ml，因乙腈可促使蛋白質(zhì)變性而沉淀，稍經(jīng)放置過濾即可獲得澄清的溶液，過濾后直接用于超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定，色譜峰形、靈敏度俱佳。

2.3 線性范圍和檢出限

將1.5中制備的基質(zhì)加標(biāo)樣品，按照本文處理方法制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，所得各溶液中三聚氰胺濃度依次為:0.25、0.5、2.5、5、10、25 ng/ml，進(jìn)樣測(cè)定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=596.28X+341.62，相關(guān)系數(shù)優(yōu)于0.995。

空白樣品中添加0.05 mg/kg三聚氰胺時(shí)，測(cè)定三聚氰胺定量離子對(duì)信噪比s/n大于20，因此確定該方法的檢出限為0.05 mg/kg。

2.4 方法的精密度和準(zhǔn)確度

對(duì)一個(gè)陽性松花蛋樣品，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果見表4，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.92%，可見采用該方法測(cè)定禽蛋制品中三聚氰胺具有較好的精密度。

在不含三聚氰胺的雞蛋、鴨蛋、咸鴨蛋、松花蛋等樣品中分別添加0.05、0.1、1.0 mg/kg的三聚氰胺標(biāo)樣，每個(gè)水平進(jìn)行5次平行測(cè)定，平均回收率為89.4%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.35%～6.37%。