摘要:本試驗(yàn)根據(jù)GenBank已公布的鵝細(xì)小病毒B株基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增VP3基因的特異性引物，對(duì)鵝細(xì)小病毒延邊分離株基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，得到了約為1500bp的VP3基因片段，將其回收純化后與pMD-18T simple載體連接，然后進(jìn)行克隆，經(jīng)雙酶切分析、PCR鑒定及測(cè)序，驗(yàn)證了所克隆的基因是鵝細(xì)小病毒VP3基因。用EcoR I和XhoⅠ雙酶切該片段并回收該片段，將此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-1原核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒PGEM-VP3，經(jīng)PCR鑒定，限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切分析，證實(shí)了重組質(zhì)粒的正確性。

關(guān)鍵詞:鵝細(xì)小病毒;VP3基因;原核表達(dá)

Abstract: Specific primers for VP3 amplicafion

was designed according to the publiced goose parvovirus strain B gene sequence in GenBank.The genome DNA was amplified by PCR， which amplified a fragment about 1500 bp.It was purified and connected with pMD-18T simple vector and then transformed to E.coli BL21 competent cells for cloning， cutting by two-enzyme，then PCR and sequencing to identify.The result showed that the cloning gene is the goose parvovirus VP3， then got the fragment and prokaryotic expressionby vector by EcoR Iand BamH I digestion .And obtained recombinant plasmid PGEM-VP3 by linking prokaryotic expressionby vecto r PGEM-4T-1，and identified by PCR、double restriction enzyme analysis and sequence analysis，the result showed that it’s true.

Key words:gosling plague virus; VP3 gene; prokaryotic

前言

鵝細(xì)小病毒病俗稱(chēng)為小鵝瘟，是由鵝細(xì)小病毒引起的主要侵害4-20日齡雛鵝和雛番鴨的一種高度接觸性和敗血性傳染病[1，2] 。由于該病病程短，傳播速度快，死亡率高，是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的最重要的傳染病之一，造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。從而引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視[3，4]。其中VP3是該病毒的主要衣殼蛋白和重要保護(hù)性抗原，且可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[5-7]。本研究利用原核表達(dá)載體PGEM-4T-1，構(gòu)建鵝細(xì)小病毒VP3基因原核表達(dá)質(zhì)粒，目的在于將體外表達(dá)的基因作為免疫原，為研制鵝細(xì)小病毒VP3基因亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒與菌種

GPV為本實(shí)驗(yàn)室從延邊某養(yǎng)鵝場(chǎng)發(fā)生小鵝瘟的病死鵝脾臟中分離的病毒。將該病毒液用生理鹽水適當(dāng)稀釋后，尿囊腔接種于12-14日鵝胚，收集72-120h內(nèi)死亡的鵝胚尿囊液，4℃，5000r/min離心30min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆?。感受態(tài)菌BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、蛋白酶K、IPTG、X-gal、酵母提取物、胰蛋白胨、Amp、Marker(DL2 000、DL1 5000)、DNA凝膠回收試劑盒、ExTaq、rTaq均購(gòu)自寶生物(大連)生物工程公司。SDS、Tris飽和酚和低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。原核表達(dá)載體PGEM-4T-1由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝細(xì)小病毒(GPV)B株全基因序列，針對(duì)VP3基因保守區(qū)，利用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物，由寶生物(大連)生物工程公司合成，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1500bp，序列如下:

P1:5′- CGC GGATCC GCC GAT GGA GTG GGT AAT GCC T - 3′

P2:5′- CCG CTCGAG CTG GTG AAC TGG ATT TCT GGG - 3′

1.2.2病毒核酸的提取

病毒核酸的提取按文獻(xiàn)(5)方法進(jìn)行。

1.2.3VP3基因PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系:滅菌去離子水:12.3micro;L，10x PCR Buffer:2micro;L，dNTP:1micro;L，P1:1micro;L，P2:1micro;L，鵝細(xì)小病毒DNA:2.5micro;L，Ex Taq:0.2micro;L。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，53℃退火45s，72℃延伸2min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后于72℃再延伸5min。電泳鑒定:取5micro;L PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4PCR產(chǎn)物的克隆

取50micro;L陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收VP3基因片段。將回收的VP3基因與克隆載體pMD-18T simple進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中。挑取轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性白色單菌接種于5mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后用質(zhì)粒小量制備法提取質(zhì)粒。將提取的重組質(zhì)粒分別用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定和PCR鑒定。

1.2.5序列測(cè)定與分析

將鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒菌液送至上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN、DNAstar軟件進(jìn)行核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分析。

1.2.6 目的基因與表達(dá)載體的連接和轉(zhuǎn)化

將酶切的目的基因與載體按3:l的體積混合，在T4DNA連接酶的作用下4℃過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞涂布平板，挑取單個(gè)白色菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定。命名為PGEM-VP3。

2 結(jié)果

2.1 VP3基因PCR擴(kuò)增

產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在1500bp處有一明顯的條帶，與預(yù)期片段大小相符，結(jié)果見(jiàn)圖1。

Fig 1 PCR amplification result of VP3 gene of GPV

M:DL2 000 DNA Marker;1:鵝細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物; 2:病料中鵝細(xì)小病毒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物; 3:陰性對(duì)照:健康雛鵝臟器上清基因組DNA;4:空白對(duì)照:滅菌的去離子水

2.2重組質(zhì)粒pMD18-VP3的PCR鑒定

將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1500bp處有一清晰的條帶，與預(yù)期片段大小一致，結(jié)果見(jiàn)圖2。

Fig 2 Electrophoresis of amplification of recombinant plasmid YB

M:DL2 000 DNA Marker;1-2:重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3:陰性對(duì)照:健康雛鵝臟器上清基因組DNA;4:空白對(duì)照:滅菌的去離子水

2.3重組質(zhì)粒pMD18-VP3雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切得到兩條特異性基因片段，一條約為1 500bp，另一條

約為2 700bp，所得結(jié)果與理論值相符。(見(jiàn)圖3)

Fig 3 Electrophoresis of resis of recombinant plasmid YB digested

by BamH Ⅰ and XhoⅠ

M1:DL2 000 DNA Marker; M2:DL 15 000bp DNA Marker;

1，2: BamH Ⅰ and XhoⅠ 雙酶切鑒定:片段大小約為1 500bp和2 700bp

2.4重組質(zhì)粒pMD18-VP3的測(cè)序鑒定

測(cè)序結(jié)果與GenBank中發(fā)表B株的序列同源性為96.5 ，說(shuō)明目的基因(VP3)已經(jīng)被成功克隆到pMD18-T Simple載體上。

2.5 重組質(zhì)粒pGEX-VP3的PCR鑒定和酶切鑒定

對(duì)初步篩選為陽(yáng)性的重組亞克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。

Fig 4 Identification for pGEX -VP3 by PCR and restriction enzyme digestion

M1:DL2 000 DNA Marker; M2:15000bP DNA Ladder Marker;

1: BamH Ⅰ and XhoⅠ 雙酶切鑒定:片段大小約為1 500bp和4 900bp

2:重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討論

由于原核表達(dá)系統(tǒng)常受到目的基因本身結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和蛋白質(zhì)折疊諸多因素的影響，本研究所用的融合表達(dá)載體pGEX-4T-1，該載體帶有非常強(qiáng)的tac啟動(dòng)子，融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)可以克服轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)外源基因表達(dá)帶來(lái)的不利影響，是一種高效的蛋白表達(dá)載體，GST標(biāo)簽便于目的蛋白的進(jìn)一步純化。

VP3是鵝細(xì)小病毒主要衣殼蛋白，約占衣殼蛋白總含量的80%，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，Zadori等通過(guò)GPV與AAV2衣殼蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬比較分析發(fā)現(xiàn)，VP3可能是暴露于鵝細(xì)小病毒表面的多肽，內(nèi)含有鵝細(xì)小病毒主要抗原決定簇成分，是鵝細(xì)小病毒主要免疫保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有中和作用的抗體。因此本試驗(yàn)以pGEX-4T-1為載體，構(gòu)建了pGEX-VP3原核表達(dá)質(zhì)粒，為亞單位疫苗的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

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作者簡(jiǎn)介:金東春(1969-)，男，朝鮮族，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，博士。

第二作者簡(jiǎn)介:杜秋明(1986—)，男，漢族，吉林省舒蘭市人，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，在讀碩士. 研究方向:動(dòng)物傳染病。

基金項(xiàng)目:吉林省牧業(yè)管理局項(xiàng)目;項(xiàng)目編號(hào):吉牧科字第200902號(hào);