張任群　饒愛(ài)華　歐陽(yáng)桂芳

近年來(lái)的研究表明，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)結(jié)果對(duì)于確定白血病的診斷與分型至關(guān)重要。以往采用橫向分析的方法對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型的報(bào)道較多，而對(duì)于某一個(gè)特定標(biāo)志在白血病免疫學(xué)診斷中的作用報(bào)道較少。筆者采用CD45／SSC雙參數(shù)設(shè)門(mén)的多色FCM，對(duì)CD15在264例白血病患者白血病細(xì)胞中的表達(dá)作了分析，以進(jìn)一步探討CD15對(duì)白血病患者的診斷意義。

1對(duì)象與方法

1，1對(duì)象

2001年3月--2007年8月來(lái)本院就診以及外院送本院作細(xì)胞表面標(biāo)記檢查的白血病初診患者264例為觀(guān)察對(duì)象，其中男141例，女123例；年齡18-73歲，中位年齡48歲。急性白血病249例，按FAB標(biāo)準(zhǔn)診斷為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)63例，急性髓細(xì)胞白血病(AML)186例；慢性粒細(xì)胞白血病(CML)15例，其中慢性期8例，急變期7例。

1，2方法

化療前采骨髓或靜脈血，肝素鈉抗凝。常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，用0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值為7.4)制成細(xì)胞濃度為106／mL的單細(xì)胞懸液備用。

1，2，1試劑

所用標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體(單抗)包括FITC、PE、PerCP或APC標(biāo)記的CD10、CD19、CD20、CD22、CD2、CD3，CD5、CD7、CD56、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD41a、CD61、CD34、CD117、CD38、CD45、HLA—DR、髓過(guò)氧化物酶(MPO)等單抗均購(gòu)自美國(guó)Becton—Dickinson公司。

1，2，2染色

白血病細(xì)胞膜染色按多色直接免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行染色。胞漿內(nèi)MPO、CD22和CD3的檢測(cè)首先用1.0％的多聚甲醛固定，后加透膜劑，再進(jìn)行三色直接免疫熒光標(biāo)記法染色。PBS充分洗滌后行FCM檢測(cè)。各樣本均以4種熒光素標(biāo)記的無(wú)關(guān)同型Ig亞類(lèi)(均購(gòu)自美國(guó)Becton—Dickinson公司)作為陰性對(duì)照。

1，2，3 FCM檢測(cè)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton－Dickinson)和CeUQuest軟件獲取并分析10 000個(gè)細(xì)胞。通過(guò)CD45／SSC設(shè)門(mén)識(shí)別幼稚細(xì)胞群，再分析計(jì)算該幼稚細(xì)胞群各白血病相關(guān)抗原的陽(yáng)性率。以白血病細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性率≥20.0％為抗原陽(yáng)性病例。

1，3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SAS 6.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，作相關(guān)分析和x²檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2，1 CD15在各類(lèi)白血病中的表達(dá)

186例AML患者中表達(dá)CD15有110例，陽(yáng)性率為59.1％，63例ALL患者中只有11例表達(dá)CD15，陽(yáng)性率為17.4％。CD15在AML中的陽(yáng)性率高于在ALL中的陽(yáng)性率(x²=41.2，P<0.01)。8例CML慢性期患者CD15均陽(yáng)性，其CD11b亦均陽(yáng)性，但CD34陰性；另7例CML急變期患者CD15陰性，其CD11b亦陰性，但CD34陽(yáng)性。

2，2 CD15在AML各亞型中的表達(dá)

CD15在M0／M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7中陽(yáng)性率見(jiàn)表1。CD15在M5b中的表達(dá)率較高，為100.0％，高于其在粒細(xì)胞系亞型白血病(M0／M1、M2、M3)中的表達(dá)(x²=10.54，P<0.01)。8例M5a患者中CDl5陽(yáng)性的4例。2.3 AML患者的CDl5表達(dá)與CD34、CD117、CD14和CD11b表達(dá)的相關(guān)性

在186例AML中，CD15與CD34、CD117的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.22，P<0.05；r=-0.29，P<0.05)，與CD14、CD11b的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.53，P<0.01；r=0.40，P<0.01)

3討論

白血病患者FCM分析在白血病臨床診斷中的作用越來(lái)越受到重視，隨著該技術(shù)的不斷普及及臨床實(shí)際工作的需要，非常有必要對(duì)每個(gè)單一標(biāo)志在白血病中的診斷作用及其局限性予以闡明。CDl5(又叫粒細(xì)胞相關(guān)抗原，或Lewisx)是細(xì)胞黏附分子(CAMs)的成員，由半乳糖、巖藻糖和N－乙酰葡萄糖胺組成的碳水化合物抗原，屬選擇素家族成員中的P選擇素(CMP－140)和E－選擇素(ELAM－1)的配基。正常情況下，它主要在成熟單核細(xì)胞、粒細(xì)胞上表達(dá)。白血病免疫表型研究發(fā)現(xiàn)，CDl5屬于髓系相關(guān)分化抗原，但它在各亞型AML以及淋巴系白血病中的交叉情況不甚明確，且由于所采用的研究方法、試劑質(zhì)量等的不同，各研究報(bào)道不盡相同。目前，采用CD45／SSC雙參數(shù)設(shè)門(mén)策略的多參數(shù)FCM分析白血病的免疫學(xué)特征標(biāo)準(zhǔn)方法，能清楚地區(qū)分骨髓或外周血中的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和原始細(xì)胞群。筆者嚴(yán)格采用這一方法和應(yīng)用一系列高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)單抗對(duì)較大樣本白血病細(xì)胞CDl5的表達(dá)作了較為詳細(xì)的分析，結(jié)果可靠。在264例白血病患者中，59.1％的AML患者中CDl5表達(dá)陽(yáng)性，而ALL患者陽(yáng)性率僅為17.4％。因此，結(jié)合髓系以及淋系的一些特異性抗原表達(dá)情況，CD15有助于髓系和淋系白血病的區(qū)分。CD25在急性單核細(xì)胞白血病(M5b)患者表達(dá)高，陽(yáng)性率為100.0％，而在粒細(xì)胞系白血病(M0／M1、M2、M3)病例中的陽(yáng)性率分別為31.4％、50.0％和50.0％，因此，CD15有助于M5b與M0／M1、M2、M3的區(qū)分。在M5病例中，CD25在分化較好的急性單核細(xì)胞白血病(M5b)中100.0％表達(dá)，而在分化較差的單核細(xì)胞白血病(M5a)中的陽(yáng)性率僅為50.0％，這可能有助于M5的分型，由于病例數(shù)較少，有待進(jìn)一步積累觀(guān)察。另外。在AML病例中，我們發(fā)現(xiàn)CD15與CD34、CD117的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，與CD14、CD11b表達(dá)呈正相關(guān)。一般認(rèn)為，CD34和CD117是不成熟的分化抗原，而CD14和CD11b是較為成熟的髓細(xì)胞系標(biāo)志，說(shuō)明CD15也是一個(gè)髓系細(xì)胞分化較為成熟的標(biāo)志。文獻(xiàn)報(bào)道CD15和CD117結(jié)合分析可監(jiān)測(cè)AML殘留病。在4例CML病例中，CD15在CML慢性期病例中表達(dá)，而在急變期細(xì)胞上則不表達(dá)，提示CD15的檢測(cè)可能有助于CML慢性期與急性期的鑒別，同時(shí)結(jié)合CD15以及CD117、CD34表達(dá)的觀(guān)察可能有助于CML細(xì)胞分化程度的判斷，但由于病例數(shù)過(guò)少，有待于進(jìn)一步積累病例數(shù)加以分析。綜上所述，本文資料表明：①CD15結(jié)合髓系以及淋系的一些特異性抗原表達(dá)情況，有助于髓系和淋系白血病的區(qū)分；②CD15有助于M5b與M0、M1、M2、M3的區(qū)分；③結(jié)合CD11b以及CD34的表達(dá)情況，有助于CML的診斷。