劉 洋，張愛華 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

劉 煜 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 荊州 434000)

曾昭淳 (重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016)

孫厚良 (重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 萬州 404000)

重組蛋白F3-Restin生物學(xué)活性的初步研究

劉 洋，張愛華 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

劉 煜 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 荊州 434000)

曾昭淳 (重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016)

孫厚良 (重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 萬州 404000)

目的：表達(dá)有生物學(xué)活性的新型融合蛋白F3-Restin，并純化、鑒定，探討F3-Restin融合肽的生物學(xué)活性。方法：在20℃、10h的條件下，IPTG誘導(dǎo)融合表達(dá)載體PET32a(+)-F3-Restin原核表達(dá)、純化，得到分子量約為40kD的高純度的可溶性蛋白F3-Restin，檢測與HUVEC的親和活性，CAM試驗(yàn)檢測抗血管活性。結(jié)果：重組蛋白F3-Restin具有特異結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，并能抑制新血管的生成。結(jié)論：初步表明新型融合蛋白F3-Restin仍具特異結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制新血管生長的能力。

F3-Restin蛋白；融合表達(dá)；抗血管生成

通過抑制或破壞腫瘤新生血管形成及生長，切斷腫瘤的給養(yǎng)途徑，可以有效達(dá)到控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的，F(xiàn)olkman[1]1972年提出的這一“抗腫瘤新生血管形成”的設(shè)想已然成為當(dāng)今癌癥治療研究的熱點(diǎn)[2，3]。編碼人類高遷移組蛋白2(HMGN2)N端31個(gè)氨基酸的F3肽能將其攜帶的噬菌體或綠色熒光蛋白特異性靶向腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞[4]，因此可以利用F3肽作為靶向腫瘤的藥物載體用于腫瘤的靶向治療。1999年，Ramchandran[5]首先克隆并表達(dá)了人膠原XV的C末端非膠原結(jié)構(gòu)域(NC10 domain of α1 chain of collagen type xv)，并將其命名為restin，此肽段由180個(gè)氨基酸組成。序列分析表明，restin與內(nèi)皮抑素(endostatin)同源，可靶向抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和生長。我們采用亞克隆技術(shù)已經(jīng)構(gòu)建人F3-Restin基因的融合表達(dá)載體PET32a(+)-F3-Restin，并成功表達(dá)可溶性的目的蛋白[6]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究此種新型融合肽F3-Restin靶向腫瘤新生血管和抗腫瘤血管生長的活性及作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株 大腸桿菌DH5α、BL21(DE3) 由本實(shí)驗(yàn)室保存, PET32a(+)載體購自Merck公司，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUEVC由重慶醫(yī)科大學(xué)組胚教研室提供，人正常肝細(xì)胞L02由重慶醫(yī)科大學(xué)肝炎所提供。

1.1.2主要試劑 IPTG購自TaKaRa公司，異硫氰酸熒光素(FITC)及其他主要試劑為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1F3-Restin表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化、鑒定 用1.0mmol/L的IPTG于20℃、10h誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)化PET32a(+)-F3-Restin的大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)，經(jīng)Ni2+-NTA 瓊脂糖樹脂親和層析純化，透析去鹽，得到分子量約為40kD的高純度的蛋白[6]。Western blotting鑒定, Bradford 法對純化的蛋白定量。

1.2.2異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記蛋白及與血管內(nèi)皮細(xì)胞親和活性的測定 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人正常肝細(xì)胞(L02)分別接種于放有放有薄的蓋玻片的24孔板中，24h貼壁后換液，加入異硫氰酸熒光素( FITC) 標(biāo)記的純化后的F3-Restin，24h后取出蓋玻片，用磷酸鹽緩沖液( PBS) 沖洗3 次，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記的蛋白在細(xì)胞的分布并照相。

1-蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(14.4，29.0，44.3，66.2，94.0KU)；2-純化的重組蛋白F3-Restin。 圖1 Western blotting鑒定重組蛋白F3-Restin

1.2.3F3-Restin抗血管活性檢測 采用雞胚絨毛膜尿囊膜試驗(yàn)(CAM)。取9d齡受精雞胚，蛋殼上開口，分別以浸有6μg F3-Restin和6μl PBS的1cm2無菌濾紙小塊貼于雞胚絨毛膜尿囊膜上，37℃，培養(yǎng)48h，剝開蛋殼，去除濾紙，光學(xué)顯微鏡下觀察6組雞胚絨毛膜尿囊膜上血管生成情況。

2 結(jié) 果

2.1重組蛋白F3-Restin的鑒定經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Ni2+-NTA 瓊脂糖樹脂親和層析純化，透析去鹽，得到的分子量約為40kD的高純度的蛋白[6]。通過Western blotting鑒定(見第91頁彩色圖版Ⅳ之圖1)。

2.2與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)親和活性FITC 標(biāo)記的蛋白與HUVEC、L02 細(xì)胞共培養(yǎng)后，于熒光顯微鏡下檢測顯示，重組蛋白F3-Restin高選擇性的靶向HUVEC細(xì)胞, 而對照組L02細(xì)胞幾乎檢測不到熒光(見第91頁彩色圖版Ⅳ之圖2)。

2.3抗血管活性雞胚絨毛膜尿囊膜(CAM)試驗(yàn)結(jié)果顯示：對照組血管呈葉狀生長，加PBS后，血管密度無降低；而重組蛋白F3-Restin實(shí)驗(yàn)組加樣后能明顯抑制雞胚絨毛膜尿囊膜血管生成(見第91頁彩色圖版Ⅳ之圖3)。

圖2 重組蛋白F3-Restin與HUVEC親和性檢測結(jié)果

圖3 重組蛋白F3-Restin對雞胚絨毛膜尿囊膜(CAM) 血管生成的影響果

3 討 論

目前用于蛋白標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達(dá)明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在堿性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的ε氨基共價(jià)結(jié)合，標(biāo)記后的蛋白仍保持相應(yīng)的結(jié)合能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測[7]。實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ITC保存于4℃暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時(shí)開蓋稱取，以避免潮解；FITC-DMSO液要臨用時(shí)配制，碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。此外，加入標(biāo)記蛋白的量一定要適當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過條件優(yōu)化，在200μl的培養(yǎng)液中加入10μl的F3-Restin，可以得到比較理想的結(jié)果。

雞胚絨毛膜尿囊膜(CAM)試驗(yàn)是腫瘤學(xué)和病毒學(xué)常用的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。最先由Fraser用來有關(guān)新血管生成的研究[8]，并已有很多相關(guān)的報(bào)道[9，10]，是研究藥物抗血管生成簡單有效的模型。CAM是一種體外呼吸器官，隨胚齡增加而加大，毛細(xì)血管生成增加，變化極其豐富。CAM法作為研究體內(nèi)血管效應(yīng)的一項(xiàng)實(shí)用性技術(shù)，具有實(shí)驗(yàn)材料易得、操作簡便、實(shí)驗(yàn)周期短、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果易于觀察、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，所以我們采用此方法測定F3-Restin融合肽的生物學(xué)活性。

重組蛋白F3-Restin是F3肽和Restin肽由一段6個(gè)甘氨酸組成的柔性片段連接而成。F3肽幾乎能與所有被測試的腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞高選擇性地結(jié)合。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，兔子靜脈注射HMGN-2后，在體內(nèi)能定向分布到HL-60 和 MDA-MB-435 的腫瘤生長部位[4]。Restin是血管生成抑制肽，通過抑制新血管的生成，阻斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。本文的目的就是要檢測重組蛋白F3-Restin是否仍然具有對腫瘤血管的高選擇性及抑制腫瘤新血管生成的活性。生物學(xué)活性試驗(yàn)初步表明我們的基因工程表達(dá)產(chǎn)物F3-Restin，仍具有靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，具有顯著抑制體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖及體內(nèi)抗新血管生成活性，為進(jìn)一步研究融合蛋白F3-Restin的功能及作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ),有望開發(fā)出更安全、更有效的抗腫瘤生物制劑。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.005

R34

A

1673-1409(2009)04-R011-02

2009-09-29

劉洋(1979-)，男，湖北潛江人，講師，碩士，從事腫瘤生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)與研究工作。