劉 兵 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 荊州 434023)
歐 微 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院內(nèi)科,湖北 荊州 434000)
彭超華 (武漢工業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430023)
胎鼠中腦腹側(cè)與額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞生物特性差異的比較
劉 兵 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 荊州 434023)
歐 微 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院內(nèi)科,湖北 荊州 434000)
彭超華 (武漢工業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430023)
目的:比較昆明小鼠胚胎中腦腹側(cè)與額葉皮質(zhì)來源的神經(jīng)干細(xì)胞生物特性的差異,為更好的研究和利用神經(jīng)干細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。方法:無菌條件下分離胚鼠中腦腹側(cè)組織與額葉皮質(zhì),經(jīng)消化及機(jī)械吹打成單細(xì)胞后接種于含有B27、bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基,培養(yǎng)擴(kuò)增;倒置顯微鏡觀察比較生長狀況;機(jī)械方法傳代;10%血清接種分化;免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及其子代細(xì)胞的分化方向,并作比較。結(jié)果:小鼠胚胎中腦腹側(cè)與額葉皮質(zhì)均存在神經(jīng)干細(xì)胞,其免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定均呈Nestin陽性;但額葉皮質(zhì)所含神經(jīng)干細(xì)胞明顯多于中腦腹側(cè),也更宜成球;結(jié)論:同樣條件下,額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞比中腦腹側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞更易培養(yǎng)與增殖,但分化較晚。
神經(jīng)干細(xì)胞;分離;培養(yǎng);差異
神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)是一種具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞。它處于分化的非終末狀態(tài),可通過對(duì)稱或不對(duì)稱分裂出新的干細(xì)胞或分化潛能逐漸變小的子細(xì)胞,最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細(xì)胞,即神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。NSCs存在于胚胎和成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的若干區(qū)域。在成年哺乳動(dòng)物和晚期胚胎中,NSCs存在的部位和數(shù)量都較少,而在早期胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NSCs則廣泛存在。 但進(jìn)年研究同時(shí)表明,不同腦區(qū)來源的NSC特性并不完全相同,即NSC的“區(qū)域差異性”(regional differentions)[1]。胎腦皮質(zhì)是NSC的常用取材區(qū); 腹側(cè)中腦是多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)源地,已被有些實(shí)驗(yàn)室證實(shí)存在神經(jīng)干細(xì)胞[2,3]。為在體外得到足夠數(shù)量的DA能神經(jīng)元以提供PD細(xì)胞移植供體,本研究分別從昆明胎鼠大腦中腦腹側(cè)和皮質(zhì)分離出神經(jīng)干細(xì)胞,旨在比較以上兩個(gè)區(qū)域來源的NSCs在分離培養(yǎng)方面的差異 ,深入了解神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性,為進(jìn)一步探討小鼠胚胎NSC移植的臨床研究奠定基礎(chǔ)。
1.1材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕11~15d昆明小鼠(E11-E15d SPF級(jí))由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.1.2試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基,特優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS),B27均購自GIBCO公司(USA);堿性成纖維生長因子(bFGF)購自Peprotech公司(USA); 胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚賴氨酸(PLL)和DAPI購自SIGMA公司(USA)。抗體:羊抗鼠anti-nestin單克隆一抗及相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗;小鼠抗大鼠anti-TH單克隆一抗以及相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗均購自美國Alpha Diagnostic Intl.Inc公司;其余試劑均為市購。
1.2方法兩種NSCs的分離、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、分化和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定見文獻(xiàn)[4,5]。
2.1中腦NSC的原代及傳代培養(yǎng)細(xì)胞孕12~13d的胚鼠中腦腹側(cè)組織以5×105/ml單細(xì)胞懸液接種時(shí),中腦神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼蘭染色示細(xì)胞胞體較小,24h后可見大量細(xì)胞呈碎渣樣死亡,死亡細(xì)胞幾乎達(dá)到一半,存活細(xì)胞沉底、圓形、晶亮,未見突起,同時(shí)皿底也可見散在分布的突起狀細(xì)胞。36h后細(xì)胞形成2~5個(gè)細(xì)胞的聚集體,還可見許多漂浮的碎片樣聚集物(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖1),4d時(shí)聚集體增大形成幾十個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)球,細(xì)胞之間界限不很清楚,球狀團(tuán)塊周圍有光暈,呈懸浮狀態(tài),此為典型的神經(jīng)干細(xì)胞球。6d時(shí)神經(jīng)球直徑約10~15μm(×100),分布約50~80個(gè)/cm2,活力較好。培養(yǎng)至7天時(shí),球體較大,神經(jīng)球直徑可達(dá)15~20μm(×100)(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖2)。在7~10d的培養(yǎng)期間,可見部分原先懸浮的神經(jīng)球貼附于未包被任何基質(zhì)的皿底,并伸出細(xì)長絲狀聯(lián)系與短的突起,其余神經(jīng)球仍呈懸浮生長,這一現(xiàn)象隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多。中腦NSCs傳代培養(yǎng)生長性狀基本同原代,經(jīng)機(jī)械吹打傳代后死亡細(xì)胞較多,部分單細(xì)胞2d后出現(xiàn)分裂相,隨后逐漸形成神經(jīng)球,生長速度基本同原代。
圖1 原代培養(yǎng)36h中腦神經(jīng)干細(xì)胞(×100) 圖2 原代培養(yǎng)7d中腦神經(jīng)干細(xì)胞(×100)
圖3 原代培養(yǎng)36h的皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞(×100) 圖4 原代培養(yǎng)6d的皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞(×100)
圖5 有血清分化6d皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞(×100) 圖6 中腦神經(jīng)球Nestin染色呈陽性(×100)
2.2皮質(zhì)NSC的原代及傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種早期的額葉皮質(zhì)干細(xì)胞胞體較中腦的略大,圓形,未見突起,光鏡下折光性好,晶亮;24h可見大部分細(xì)胞沉底,無突起,細(xì)胞間有少量死亡細(xì)胞呈碎渣樣;36h可見沉底的細(xì)胞形成5~10個(gè)細(xì)胞的聚集體(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖3);2d可見聚集體增大,懸浮,形成十幾個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)球(neurosphere),以后細(xì)胞球繼續(xù)增大,5~7d細(xì)胞球直徑可達(dá)20~25μm(×100),此時(shí)神經(jīng)球分布約50~100個(gè)/cm2,球體均勻致密,細(xì)胞晶瑩透亮,周邊可見明顯分裂相細(xì)胞(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖4);繼續(xù)生長球體直徑增大,中央出現(xiàn)黃褐色,為營養(yǎng)缺乏所致。我們證實(shí)連續(xù)培養(yǎng)14d神經(jīng)球不貼壁但后期增長速度明顯放慢,細(xì)胞球因營養(yǎng)缺乏而成片聚集死亡。經(jīng)機(jī)械吹打傳代后死亡細(xì)胞很多,部分單細(xì)胞2d后出現(xiàn)分裂相,隨后漸形成細(xì)胞團(tuán)及神經(jīng)球,生長速度基本同原代;未被完全吹散的部分神經(jīng)球可見迅速在周邊長出新的折光性強(qiáng)而透亮的細(xì)胞,再次成球;而部分未被完全吹散的神經(jīng)球可能由于機(jī)械吹打損傷而死亡。
2.3兩種NSC的分化將培養(yǎng)的神經(jīng)球轉(zhuǎn)入有血清培養(yǎng)時(shí),3h即可看到細(xì)胞球貼壁,12h可看到貼壁細(xì)胞球伸出細(xì)長突起;3d左右形態(tài)明顯的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞球中遷移出來,突起延長增粗,細(xì)胞與細(xì)胞之間突起形成網(wǎng)狀纖維聯(lián)系;隨著時(shí)間延長突起繼續(xù)延長增多、球體之間也形成大的纖維網(wǎng)絡(luò)(中腦與皮質(zhì)類似)(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖5)。中腦神經(jīng)球體10d左右可完全分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞,而皮質(zhì)球則約需要2~3周。
小鼠胚腦中腦與皮質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光染色顯示,神經(jīng)球細(xì)胞表達(dá)巢蛋白(nestin)抗原(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖6),能分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,表明它們屬于神經(jīng)干細(xì)胞。
神經(jīng)干細(xì)胞普遍存在于胎腦內(nèi),但神經(jīng)干細(xì)胞并不是指某一種特定的、單一類型的細(xì)胞,而是具有相類似性質(zhì)的細(xì)胞群。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)來源于小鼠胎腦皮質(zhì)和中腦的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行了成功的分離、培養(yǎng)和傳代。培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞形成神經(jīng)球,這是神經(jīng)干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的重要特征。神經(jīng)球表達(dá)Nestin這種特異性的標(biāo)記物,以及能分化為神經(jīng)元和交織細(xì)胞,證實(shí)了其干細(xì)胞屬性。不同區(qū)域來源的NSCs具有不同的生長特性,這一點(diǎn)在我們的實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。
在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)和中腦來源的神經(jīng)干細(xì)胞在生長特性方面存在如下不同:①分離方面。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中,我們?nèi)∵^孕11~15d的小鼠,從細(xì)胞存活與操作技術(shù)方面綜合考慮,孕11~13d是中腦取材較佳的時(shí)機(jī),而對(duì)于皮質(zhì)區(qū)孕13~15d取材最佳。這是因?yàn)榕咛ヌ鞌?shù)越小,腹側(cè)中腦的存活率越高,但也給取材操作尤其是皮質(zhì)的分離帶來不便,此時(shí)腦實(shí)質(zhì)與腦膜分離很困難,造成NSC的純度不高。實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)分離的腹側(cè)中腦組織較硬,細(xì)胞較難分離,認(rèn)為機(jī)械吹打分離對(duì)中腦較宜,我們認(rèn)為對(duì)消化的把握是培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵。②培養(yǎng)方面。神經(jīng)干細(xì)胞的存活與生長需要一定的細(xì)胞密度支持。本研究中我們發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)NSC以(2~3)×105接種為宜,細(xì)胞存活率約為80%;而中腦NSC的細(xì)胞存活率不到1%,因此要適當(dāng)提高中腦區(qū)細(xì)胞的接種密度,且為了防止死細(xì)胞影響建議加入DNAase,阻止死細(xì)胞核酸粘連。中腦NSC以5×105接種為宜,③生長方面。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出相同種植條件下皮質(zhì)NSC比中腦NSC形成神經(jīng)球要早,球體直徑要大,克隆形成率也高的多,這可能由于:中腦NSC比皮質(zhì)區(qū)少,干細(xì)胞的生長密度依賴性限制了中腦NSC的成球[6];此外,二者由于細(xì)胞亞群不同,對(duì)絲裂原信號(hào)bFGF的反應(yīng)不同。bFGF對(duì)皮質(zhì)NSC的刺激較強(qiáng),而中腦NSC對(duì)表皮生長因子(EGF)的反應(yīng)更劇[7]。根據(jù)上述情況,我們認(rèn)為同樣條件下皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞比中腦神經(jīng)干細(xì)胞要易于培養(yǎng)與增殖。
神經(jīng)干細(xì)胞在分化上具有多能性,即它們都具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力,這在我們的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí),即無論是皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞還是中腦神經(jīng)干細(xì)胞均可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。但它們存在“區(qū)域差異性”,即不同部位來源的神經(jīng)干細(xì)胞具有不同的生長與分化特異性, 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),中腦區(qū)NSC分化的速度明顯快于皮質(zhì)區(qū)NSC.兩種NSCs球轉(zhuǎn)入有血清培養(yǎng)時(shí),神經(jīng)干細(xì)胞球貼壁與開始伸出突起的時(shí)間無明顯差異,但分化4~5d后,兩者分化速度出現(xiàn)差別,中腦NSC快,而皮質(zhì)NSC則要慢。具體而言,增殖7d的神經(jīng)球,中腦NSC10天左右可以完全分化開,而皮質(zhì)NSC則需要約3周的時(shí)間。分化速度上的差異是其“區(qū)域差異性”的表現(xiàn)之一。
總之,中腦NSC與皮質(zhì)NSC在分離、培養(yǎng)上存在典型的“區(qū)域差異性”,皮質(zhì)NSC更易于培養(yǎng)和增殖。體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的證實(shí)及神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立為治療神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、帕金森病提供了可靠的基礎(chǔ)。
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[編輯] 一 凡
10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.004
R322.83
A
1673-1409(2009)04-R008-03
2009-11-04
劉兵(1973-),男,湖北鐘祥人,講師,碩士,從事神經(jīng)生物學(xué)和斷層解剖學(xué)教學(xué)與研究工作。