劉 兵 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

歐 微 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院內(nèi)科，湖北 荊州 434000)

彭超華 (武漢工業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430023)

胎鼠中腦腹側(cè)與額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞生物特性差異的比較

劉 兵 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

歐 微 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院內(nèi)科，湖北 荊州 434000)

彭超華 (武漢工業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430023)

目的：比較昆明小鼠胚胎中腦腹側(cè)與額葉皮質(zhì)來源的神經(jīng)干細(xì)胞生物特性的差異，為更好的研究和利用神經(jīng)干細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。方法：無菌條件下分離胚鼠中腦腹側(cè)組織與額葉皮質(zhì)，經(jīng)消化及機(jī)械吹打成單細(xì)胞后接種于含有B27、bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴(kuò)增；倒置顯微鏡觀察比較生長狀況；機(jī)械方法傳代；10%血清接種分化；免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及其子代細(xì)胞的分化方向，并作比較。結(jié)果：小鼠胚胎中腦腹側(cè)與額葉皮質(zhì)均存在神經(jīng)干細(xì)胞，其免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定均呈Nestin陽性；但額葉皮質(zhì)所含神經(jīng)干細(xì)胞明顯多于中腦腹側(cè)，也更宜成球；結(jié)論：同樣條件下，額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞比中腦腹側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞更易培養(yǎng)與增殖，但分化較晚。

神經(jīng)干細(xì)胞；分離；培養(yǎng)；差異

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)是一種具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞。它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過對(duì)稱或不對(duì)稱分裂出新的干細(xì)胞或分化潛能逐漸變小的子細(xì)胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細(xì)胞，即神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。NSCs存在于胚胎和成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的若干區(qū)域。在成年哺乳動(dòng)物和晚期胚胎中，NSCs存在的部位和數(shù)量都較少，而在早期胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NSCs則廣泛存在。 但進(jìn)年研究同時(shí)表明，不同腦區(qū)來源的NSC特性并不完全相同，即NSC的“區(qū)域差異性”(regional differentions)[1]。胎腦皮質(zhì)是NSC的常用取材區(qū); 腹側(cè)中腦是多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)源地,已被有些實(shí)驗(yàn)室證實(shí)存在神經(jīng)干細(xì)胞[2，3]。為在體外得到足夠數(shù)量的DA能神經(jīng)元以提供PD細(xì)胞移植供體，本研究分別從昆明胎鼠大腦中腦腹側(cè)和皮質(zhì)分離出神經(jīng)干細(xì)胞，旨在比較以上兩個(gè)區(qū)域來源的NSCs在分離培養(yǎng)方面的差異 ，深入了解神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步探討小鼠胚胎NSC移植的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕11～15d昆明小鼠(E11-E15d SPF級(jí))由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，特優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS),B27均購自GIBCO公司(USA)；堿性成纖維生長因子(bFGF)購自Peprotech公司(USA); 胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚賴氨酸(PLL)和DAPI購自SIGMA公司(USA)。抗體：羊抗鼠anti-nestin單克隆一抗及相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗；小鼠抗大鼠anti-TH單克隆一抗以及相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗均購自美國Alpha Diagnostic Intl.Inc公司；其余試劑均為市購。

1.2方法兩種NSCs的分離、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、分化和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定見文獻(xiàn)[4，5]。

2 結(jié) 果

2.1中腦NSC的原代及傳代培養(yǎng)細(xì)胞孕12～13d的胚鼠中腦腹側(cè)組織以5×105/ml單細(xì)胞懸液接種時(shí)，中腦神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼蘭染色示細(xì)胞胞體較小，24h后可見大量細(xì)胞呈碎渣樣死亡，死亡細(xì)胞幾乎達(dá)到一半，存活細(xì)胞沉底、圓形、晶亮，未見突起，同時(shí)皿底也可見散在分布的突起狀細(xì)胞。36h后細(xì)胞形成2～5個(gè)細(xì)胞的聚集體，還可見許多漂浮的碎片樣聚集物(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖1)，4d時(shí)聚集體增大形成幾十個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)球，細(xì)胞之間界限不很清楚，球狀團(tuán)塊周圍有光暈，呈懸浮狀態(tài)，此為典型的神經(jīng)干細(xì)胞球。6d時(shí)神經(jīng)球直徑約10～15μm(×100)，分布約50～80個(gè)/cm2，活力較好。培養(yǎng)至7天時(shí)，球體較大，神經(jīng)球直徑可達(dá)15～20μm(×100)(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖2)。在7～10d的培養(yǎng)期間，可見部分原先懸浮的神經(jīng)球貼附于未包被任何基質(zhì)的皿底，并伸出細(xì)長絲狀聯(lián)系與短的突起，其余神經(jīng)球仍呈懸浮生長，這一現(xiàn)象隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多。中腦NSCs傳代培養(yǎng)生長性狀基本同原代，經(jīng)機(jī)械吹打傳代后死亡細(xì)胞較多，部分單細(xì)胞2d后出現(xiàn)分裂相，隨后逐漸形成神經(jīng)球，生長速度基本同原代。

圖1 原代培養(yǎng)36h中腦神經(jīng)干細(xì)胞(×100) 圖2 原代培養(yǎng)7d中腦神經(jīng)干細(xì)胞(×100)

圖3 原代培養(yǎng)36h的皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞(×100) 圖4 原代培養(yǎng)6d的皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞(×100)

圖5 有血清分化6d皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞(×100) 圖6 中腦神經(jīng)球Nestin染色呈陽性(×100)

2.2皮質(zhì)NSC的原代及傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種早期的額葉皮質(zhì)干細(xì)胞胞體較中腦的略大，圓形，未見突起，光鏡下折光性好，晶亮；24h可見大部分細(xì)胞沉底，無突起，細(xì)胞間有少量死亡細(xì)胞呈碎渣樣；36h可見沉底的細(xì)胞形成5～10個(gè)細(xì)胞的聚集體(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖3)；2d可見聚集體增大，懸浮，形成十幾個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)球(neurosphere),以后細(xì)胞球繼續(xù)增大，5～7d細(xì)胞球直徑可達(dá)20～25μm(×100)，此時(shí)神經(jīng)球分布約50～100個(gè)/cm2，球體均勻致密，細(xì)胞晶瑩透亮，周邊可見明顯分裂相細(xì)胞(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖4)；繼續(xù)生長球體直徑增大，中央出現(xiàn)黃褐色，為營養(yǎng)缺乏所致。我們證實(shí)連續(xù)培養(yǎng)14d神經(jīng)球不貼壁但后期增長速度明顯放慢，細(xì)胞球因營養(yǎng)缺乏而成片聚集死亡。經(jīng)機(jī)械吹打傳代后死亡細(xì)胞很多，部分單細(xì)胞2d后出現(xiàn)分裂相，隨后漸形成細(xì)胞團(tuán)及神經(jīng)球，生長速度基本同原代；未被完全吹散的部分神經(jīng)球可見迅速在周邊長出新的折光性強(qiáng)而透亮的細(xì)胞，再次成球；而部分未被完全吹散的神經(jīng)球可能由于機(jī)械吹打損傷而死亡。

2.3兩種NSC的分化將培養(yǎng)的神經(jīng)球轉(zhuǎn)入有血清培養(yǎng)時(shí)，3h即可看到細(xì)胞球貼壁，12h可看到貼壁細(xì)胞球伸出細(xì)長突起；3d左右形態(tài)明顯的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞球中遷移出來，突起延長增粗，細(xì)胞與細(xì)胞之間突起形成網(wǎng)狀纖維聯(lián)系；隨著時(shí)間延長突起繼續(xù)延長增多、球體之間也形成大的纖維網(wǎng)絡(luò)(中腦與皮質(zhì)類似)(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖5)。中腦神經(jīng)球體10d左右可完全分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，而皮質(zhì)球則約需要2～3周。

小鼠胚腦中腦與皮質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光染色顯示，神經(jīng)球細(xì)胞表達(dá)巢蛋白(nestin)抗原(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖6)，能分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，表明它們屬于神經(jīng)干細(xì)胞。

3 討 論

神經(jīng)干細(xì)胞普遍存在于胎腦內(nèi)，但神經(jīng)干細(xì)胞并不是指某一種特定的、單一類型的細(xì)胞,而是具有相類似性質(zhì)的細(xì)胞群。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)來源于小鼠胎腦皮質(zhì)和中腦的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行了成功的分離、培養(yǎng)和傳代。培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞形成神經(jīng)球，這是神經(jīng)干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的重要特征。神經(jīng)球表達(dá)Nestin這種特異性的標(biāo)記物，以及能分化為神經(jīng)元和交織細(xì)胞，證實(shí)了其干細(xì)胞屬性。不同區(qū)域來源的NSCs具有不同的生長特性，這一點(diǎn)在我們的實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)和中腦來源的神經(jīng)干細(xì)胞在生長特性方面存在如下不同：①分離方面。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們?nèi)∵^孕11～15d的小鼠，從細(xì)胞存活與操作技術(shù)方面綜合考慮，孕11～13d是中腦取材較佳的時(shí)機(jī)，而對(duì)于皮質(zhì)區(qū)孕13～15d取材最佳。這是因?yàn)榕咛ヌ鞌?shù)越小，腹側(cè)中腦的存活率越高，但也給取材操作尤其是皮質(zhì)的分離帶來不便，此時(shí)腦實(shí)質(zhì)與腦膜分離很困難，造成NSC的純度不高。實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)分離的腹側(cè)中腦組織較硬，細(xì)胞較難分離，認(rèn)為機(jī)械吹打分離對(duì)中腦較宜，我們認(rèn)為對(duì)消化的把握是培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵。②培養(yǎng)方面。神經(jīng)干細(xì)胞的存活與生長需要一定的細(xì)胞密度支持。本研究中我們發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)NSC以(2～3)×105接種為宜，細(xì)胞存活率約為80%；而中腦NSC的細(xì)胞存活率不到1%，因此要適當(dāng)提高中腦區(qū)細(xì)胞的接種密度，且為了防止死細(xì)胞影響建議加入DNAase,阻止死細(xì)胞核酸粘連。中腦NSC以5×105接種為宜，③生長方面。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出相同種植條件下皮質(zhì)NSC比中腦NSC形成神經(jīng)球要早，球體直徑要大，克隆形成率也高的多，這可能由于：中腦NSC比皮質(zhì)區(qū)少，干細(xì)胞的生長密度依賴性限制了中腦NSC的成球[6]；此外，二者由于細(xì)胞亞群不同，對(duì)絲裂原信號(hào)bFGF的反應(yīng)不同。bFGF對(duì)皮質(zhì)NSC的刺激較強(qiáng)，而中腦NSC對(duì)表皮生長因子(EGF)的反應(yīng)更劇[7]。根據(jù)上述情況，我們認(rèn)為同樣條件下皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞比中腦神經(jīng)干細(xì)胞要易于培養(yǎng)與增殖。

神經(jīng)干細(xì)胞在分化上具有多能性，即它們都具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力，這在我們的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，即無論是皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞還是中腦神經(jīng)干細(xì)胞均可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。但它們存在“區(qū)域差異性”，即不同部位來源的神經(jīng)干細(xì)胞具有不同的生長與分化特異性， 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，中腦區(qū)NSC分化的速度明顯快于皮質(zhì)區(qū)NSC.兩種NSCs球轉(zhuǎn)入有血清培養(yǎng)時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞球貼壁與開始伸出突起的時(shí)間無明顯差異，但分化4～5d后，兩者分化速度出現(xiàn)差別，中腦NSC快，而皮質(zhì)NSC則要慢。具體而言，增殖7d的神經(jīng)球，中腦NSC10天左右可以完全分化開，而皮質(zhì)NSC則需要約3周的時(shí)間。分化速度上的差異是其“區(qū)域差異性”的表現(xiàn)之一。

總之，中腦NSC與皮質(zhì)NSC在分離、培養(yǎng)上存在典型的“區(qū)域差異性”，皮質(zhì)NSC更易于培養(yǎng)和增殖。體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的證實(shí)及神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立為治療神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、帕金森病提供了可靠的基礎(chǔ)。

[1]Ostenfeld T, Joly E, Tai YT,etal. Regional specification of rodent and human neurospheres[J]. Dev Brain Res，2002，134：43-55.

[2]Samina SR, Eric J, Gerald M S,etal. The controlled conversion of human neural progenitor cells derived from foetal ventral mesencephalon into dopaminergic neurons in vitro[J]. Dev Brain Res，2002，136：27-34.

[3]Nishino H, Hida H, Baba H,etal. Mesencephalic neurla stem (progenitor) cells develop to dapaminergic neurons strongly in dopamine-depleted striatum than in intact striatum[J]. Exp Neurol，2000, 164：209-214.

[4]劉兵，劉洪濤. 小鼠胚胎中腦神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分化[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)醫(yī)學(xué)卷，2006，3(4)：252-254.

[5]劉兵，歐微，劉洪濤. 胚鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及分化[J]. 長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)醫(yī)學(xué)卷，2009，6(3)：8-10.

[6]Gage FH. Mammalian neural stem cells[J]. Science，2000, 287(5457):1433-1438.

[7]Louis RP, Katheine RH, Donghui L,etal. Isolation and manipulation of rostral mesencephalic tegmental progenitor cells from rat[J].Cell Transplantation，1995，4:335-342.

[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.004

R322.83

A

1673-1409(2009)04-R008-03

2009-11-04

劉兵(1973-)，男，湖北鐘祥人，講師，碩士，從事神經(jīng)生物學(xué)和斷層解剖學(xué)教學(xué)與研究工作。