劉 兵 (長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)

歐 微 (長江大學附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院內(nèi)科，湖北 荊州 434000)

彭超華 (武漢工業(yè)學院醫(yī)學院，湖北 武漢 430023)

胎鼠中腦腹側與額葉皮質神經(jīng)干細胞生物特性差異的比較

劉 兵 (長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)

歐 微 (長江大學附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院內(nèi)科，湖北 荊州 434000)

彭超華 (武漢工業(yè)學院醫(yī)學院，湖北 武漢 430023)

目的：比較昆明小鼠胚胎中腦腹側與額葉皮質來源的神經(jīng)干細胞生物特性的差異，為更好的研究和利用神經(jīng)干細胞奠定基礎。方法：無菌條件下分離胚鼠中腦腹側組織與額葉皮質，經(jīng)消化及機械吹打成單細胞后接種于含有B27、bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴增；倒置顯微鏡觀察比較生長狀況；機械方法傳代；10%血清接種分化；免疫細胞化學方法染色鑒定神經(jīng)干細胞及其子代細胞的分化方向，并作比較。結果：小鼠胚胎中腦腹側與額葉皮質均存在神經(jīng)干細胞，其免疫細胞化學鑒定均呈Nestin陽性；但額葉皮質所含神經(jīng)干細胞明顯多于中腦腹側，也更宜成球；結論：同樣條件下，額葉皮質神經(jīng)干細胞比中腦腹側神經(jīng)干細胞更易培養(yǎng)與增殖，但分化較晚。

神經(jīng)干細胞；分離；培養(yǎng)；差異

神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)是一種具有自我更新及多向分化潛能的細胞。它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過對稱或不對稱分裂出新的干細胞或分化潛能逐漸變小的子細胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細胞，即神經(jīng)元細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。NSCs存在于胚胎和成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的若干區(qū)域。在成年哺乳動物和晚期胚胎中，NSCs存在的部位和數(shù)量都較少，而在早期胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NSCs則廣泛存在。 但進年研究同時表明，不同腦區(qū)來源的NSC特性并不完全相同，即NSC的“區(qū)域差異性”(regional differentions)[1]。胎腦皮質是NSC的常用取材區(qū); 腹側中腦是多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)源地,已被有些實驗室證實存在神經(jīng)干細胞[2，3]。為在體外得到足夠數(shù)量的DA能神經(jīng)元以提供PD細胞移植供體，本研究分別從昆明胎鼠大腦中腦腹側和皮質分離出神經(jīng)干細胞，旨在比較以上兩個區(qū)域來源的NSCs在分離培養(yǎng)方面的差異 ，深入了解神經(jīng)干細胞的生物學特性，為進一步探討小鼠胚胎NSC移植的臨床研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 孕11～15d昆明小鼠(E11-E15d SPF級)由武漢大學實驗動物中心提供。

1.1.2試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，特優(yōu)級胎牛血清(FBS),B27均購自GIBCO公司(USA)；堿性成纖維生長因子(bFGF)購自Peprotech公司(USA); 胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚賴氨酸(PLL)和DAPI購自SIGMA公司(USA)?？贵w：羊抗鼠anti-nestin單克隆一抗及相應的熒光標記二抗；小鼠抗大鼠anti-TH單克隆一抗以及相應的熒光標記二抗均購自美國Alpha Diagnostic Intl.Inc公司；其余試劑均為市購。

1.2方法兩種NSCs的分離、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、分化和免疫細胞化學鑒定見文獻[4，5]。

2 結 果

2.1中腦NSC的原代及傳代培養(yǎng)細胞孕12～13d的胚鼠中腦腹側組織以5×105/ml單細胞懸液接種時，中腦神經(jīng)干細胞經(jīng)臺盼蘭染色示細胞胞體較小，24h后可見大量細胞呈碎渣樣死亡，死亡細胞幾乎達到一半，存活細胞沉底、圓形、晶亮，未見突起，同時皿底也可見散在分布的突起狀細胞。36h后細胞形成2～5個細胞的聚集體，還可見許多漂浮的碎片樣聚集物(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖1)，4d時聚集體增大形成幾十個細胞的神經(jīng)球，細胞之間界限不很清楚，球狀團塊周圍有光暈，呈懸浮狀態(tài)，此為典型的神經(jīng)干細胞球。6d時神經(jīng)球直徑約10～15μm(×100)，分布約50～80個/cm2，活力較好。培養(yǎng)至7天時，球體較大，神經(jīng)球直徑可達15～20μm(×100)(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖2)。在7～10d的培養(yǎng)期間，可見部分原先懸浮的神經(jīng)球貼附于未包被任何基質的皿底，并伸出細長絲狀聯(lián)系與短的突起，其余神經(jīng)球仍呈懸浮生長，這一現(xiàn)象隨培養(yǎng)時間的延長而增多。中腦NSCs傳代培養(yǎng)生長性狀基本同原代，經(jīng)機械吹打傳代后死亡細胞較多，部分單細胞2d后出現(xiàn)分裂相，隨后逐漸形成神經(jīng)球，生長速度基本同原代。

圖1 原代培養(yǎng)36h中腦神經(jīng)干細胞(×100) 圖2 原代培養(yǎng)7d中腦神經(jīng)干細胞(×100)

圖3 原代培養(yǎng)36h的皮質神經(jīng)干細胞(×100) 圖4 原代培養(yǎng)6d的皮質神經(jīng)干細胞(×100)

圖5 有血清分化6d皮質神經(jīng)干細胞(×100) 圖6 中腦神經(jīng)球Nestin染色呈陽性(×100)

2.2皮質NSC的原代及傳代培養(yǎng)細胞接種早期的額葉皮質干細胞胞體較中腦的略大，圓形，未見突起，光鏡下折光性好，晶亮；24h可見大部分細胞沉底，無突起，細胞間有少量死亡細胞呈碎渣樣；36h可見沉底的細胞形成5～10個細胞的聚集體(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖3)；2d可見聚集體增大，懸浮，形成十幾個細胞的神經(jīng)球(neurosphere),以后細胞球繼續(xù)增大，5～7d細胞球直徑可達20～25μm(×100)，此時神經(jīng)球分布約50～100個/cm2，球體均勻致密，細胞晶瑩透亮，周邊可見明顯分裂相細胞(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖4)；繼續(xù)生長球體直徑增大，中央出現(xiàn)黃褐色，為營養(yǎng)缺乏所致。我們證實連續(xù)培養(yǎng)14d神經(jīng)球不貼壁但后期增長速度明顯放慢，細胞球因營養(yǎng)缺乏而成片聚集死亡。經(jīng)機械吹打傳代后死亡細胞很多，部分單細胞2d后出現(xiàn)分裂相，隨后漸形成細胞團及神經(jīng)球，生長速度基本同原代；未被完全吹散的部分神經(jīng)球可見迅速在周邊長出新的折光性強而透亮的細胞，再次成球；而部分未被完全吹散的神經(jīng)球可能由于機械吹打損傷而死亡。

2.3兩種NSC的分化將培養(yǎng)的神經(jīng)球轉入有血清培養(yǎng)時，3h即可看到細胞球貼壁，12h可看到貼壁細胞球伸出細長突起；3d左右形態(tài)明顯的神經(jīng)元和膠質細胞從細胞球中遷移出來，突起延長增粗，細胞與細胞之間突起形成網(wǎng)狀纖維聯(lián)系；隨著時間延長突起繼續(xù)延長增多、球體之間也形成大的纖維網(wǎng)絡(中腦與皮質類似)(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖5)。中腦神經(jīng)球體10d左右可完全分化為神經(jīng)細胞和膠質細胞，而皮質球則約需要2～3周。

小鼠胚腦中腦與皮質細胞體外培養(yǎng)傳代形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光染色顯示，神經(jīng)球細胞表達巢蛋白(nestin)抗原(見第90頁彩色圖版Ⅲ之圖6)，能分化為神經(jīng)元和膠質細胞，表明它們屬于神經(jīng)干細胞。

3 討 論

神經(jīng)干細胞普遍存在于胎腦內(nèi)，但神經(jīng)干細胞并不是指某一種特定的、單一類型的細胞,而是具有相類似性質的細胞群。我們在實驗中對來源于小鼠胎腦皮質和中腦的神經(jīng)干細胞進行了成功的分離、培養(yǎng)和傳代。培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞形成神經(jīng)球，這是神經(jīng)干細胞懸浮培養(yǎng)的重要特征。神經(jīng)球表達Nestin這種特異性的標記物，以及能分化為神經(jīng)元和交織細胞，證實了其干細胞屬性。不同區(qū)域來源的NSCs具有不同的生長特性，這一點在我們的實驗中得到了證實。

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)皮質和中腦來源的神經(jīng)干細胞在生長特性方面存在如下不同：①分離方面。在整個實驗中，我們?nèi)∵^孕11～15d的小鼠，從細胞存活與操作技術方面綜合考慮，孕11～13d是中腦取材較佳的時機，而對于皮質區(qū)孕13～15d取材最佳。這是因為胚胎天數(shù)越小，腹側中腦的存活率越高，但也給取材操作尤其是皮質的分離帶來不便，此時腦實質與腦膜分離很困難，造成NSC的純度不高。實驗中我們也發(fā)現(xiàn)分離的腹側中腦組織較硬，細胞較難分離，認為機械吹打分離對中腦較宜，我們認為對消化的把握是培養(yǎng)成功與否的關鍵。②培養(yǎng)方面。神經(jīng)干細胞的存活與生長需要一定的細胞密度支持。本研究中我們發(fā)現(xiàn)皮質NSC以(2～3)×105接種為宜，細胞存活率約為80%；而中腦NSC的細胞存活率不到1%，因此要適當提高中腦區(qū)細胞的接種密度，且為了防止死細胞影響建議加入DNAase,阻止死細胞核酸粘連。中腦NSC以5×105接種為宜，③生長方面。從本實驗結果可以看出相同種植條件下皮質NSC比中腦NSC形成神經(jīng)球要早，球體直徑要大，克隆形成率也高的多，這可能由于：中腦NSC比皮質區(qū)少，干細胞的生長密度依賴性限制了中腦NSC的成球[6]；此外，二者由于細胞亞群不同，對絲裂原信號bFGF的反應不同。bFGF對皮質NSC的刺激較強，而中腦NSC對表皮生長因子(EGF)的反應更劇[7]。根據(jù)上述情況，我們認為同樣條件下皮質神經(jīng)干細胞比中腦神經(jīng)干細胞要易于培養(yǎng)與增殖。

神經(jīng)干細胞在分化上具有多能性，即它們都具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的能力，這在我們的實驗中得到證實，即無論是皮質神經(jīng)干細胞還是中腦神經(jīng)干細胞均可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞。但它們存在“區(qū)域差異性”，即不同部位來源的神經(jīng)干細胞具有不同的生長與分化特異性， 我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，中腦區(qū)NSC分化的速度明顯快于皮質區(qū)NSC.兩種NSCs球轉入有血清培養(yǎng)時，神經(jīng)干細胞球貼壁與開始伸出突起的時間無明顯差異，但分化4～5d后，兩者分化速度出現(xiàn)差別，中腦NSC快，而皮質NSC則要慢。具體而言，增殖7d的神經(jīng)球，中腦NSC10天左右可以完全分化開，而皮質NSC則需要約3周的時間。分化速度上的差異是其“區(qū)域差異性”的表現(xiàn)之一。

總之，中腦NSC與皮質NSC在分離、培養(yǎng)上存在典型的“區(qū)域差異性”，皮質NSC更易于培養(yǎng)和增殖。體內(nèi)神經(jīng)干細胞的證實及神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)方法的建立為治療神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、帕金森病提供了可靠的基礎。

[1]Ostenfeld T, Joly E, Tai YT,etal. Regional specification of rodent and human neurospheres[J]. Dev Brain Res，2002，134：43-55.

[2]Samina SR, Eric J, Gerald M S,etal. The controlled conversion of human neural progenitor cells derived from foetal ventral mesencephalon into dopaminergic neurons in vitro[J]. Dev Brain Res，2002，136：27-34.

[3]Nishino H, Hida H, Baba H,etal. Mesencephalic neurla stem (progenitor) cells develop to dapaminergic neurons strongly in dopamine-depleted striatum than in intact striatum[J]. Exp Neurol，2000, 164：209-214.

[4]劉兵，劉洪濤. 小鼠胚胎中腦神經(jīng)干細胞分離、培養(yǎng)及分化[J].長江大學學報(自科版)醫(yī)學卷，2006，3(4)：252-254.

[5]劉兵，歐微，劉洪濤. 胚鼠額葉皮質神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及分化[J]. 長江大學學報(自科版)醫(yī)學卷，2009，6(3)：8-10.

[6]Gage FH. Mammalian neural stem cells[J]. Science，2000, 287(5457):1433-1438.

[7]Louis RP, Katheine RH, Donghui L,etal. Isolation and manipulation of rostral mesencephalic tegmental progenitor cells from rat[J].Cell Transplantation，1995，4:335-342.

[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.004

R322.83

A

1673-1409(2009)04-R008-03

2009-11-04

劉兵(1973-)，男，湖北鐘祥人，講師，碩士，從事神經(jīng)生物學和斷層解剖學教學與研究工作。