楊 軍 陳紅頌，丁山河 王家圣 羅家琴，楊玉瑩，彭本英 韓安勤

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010) (湖北省畜牧獸醫(yī)局，湖北 武漢 430060) (湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010) (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025) (湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010)

3個外種豬Nramp1基因多態(tài)性研究

楊 軍 陳紅頌，丁山河 王家圣 羅家琴，楊玉瑩，彭本英 韓安勤

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010) (湖北省畜牧獸醫(yī)局，湖北 武漢 430060) (湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010) (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025) (湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010)

采用PCR-RFLP方法，對3個外種豬群Nramp1基因第6內(nèi)含子序列多態(tài)性進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，在3個外種豬群中均僅檢測到AB和BB 2種基因型，其中AB基因型為優(yōu)勢基因型，BB基因型為數(shù)極少，未檢測到AA基因型?？ǚ綑z驗結(jié)果表明，3個外種豬群該位點均處于遺傳不平衡狀態(tài)(Plt;0.01)。群體中該位點雜合度較高、純合度較低，具有中度遺傳多態(tài)性，可在后續(xù)的育種方案中實施分化選擇和培育，為抗病育種提供遺傳素材。

豬(Susscrofa)；Nramp1基因；PCR-RFLP；多態(tài)性

在動物育種中，人們一直追求主要經(jīng)濟(jì)性狀生產(chǎn)能力的提高，往往忽略隨之而來的拮抗效應(yīng)——動物體質(zhì)和抗病力的不斷減弱，使得育種成效在實際生產(chǎn)中不能完全體現(xiàn)。畜禽疾病，尤其是傳染性疾病已成為現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)的大敵，而集約化程度的提高和飼養(yǎng)條件的改變，又引起許多新的傳染病(尤其是病毒性疾病)的發(fā)生和流行。簡單的預(yù)防接種和藥物治療不但不能完全有效地解決問題，還會引發(fā)食品安全擔(dān)憂。因此，采用分子生物學(xué)手段，從遺傳素質(zhì)上提高動物的抗病力，實施抗病育種，是解決問題的有效途徑之一。最初發(fā)現(xiàn)小鼠對細(xì)胞內(nèi)病原微生物侵染所具有的抗性或敏感性是受1號染色體上顯性基因控制，并將其該類基因命名為天然抗性相關(guān)巨噬蛋白(natural resistance associated macrophage protein，Nramp)基因家族[1]。該基因家族至少有2～3個成員，動物Nramp1基因主要在吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中特異表達(dá)，通過消耗含有胞內(nèi)病原微生物的吞噬體中二價金屬離子，使病原微生物缺乏增殖所必需的離子而達(dá)到抵抗胞內(nèi)微生物的作用[2～4]。豬Nramp1基因定位于第15號染色體q23-26，基因組序列15 kb左右，包括15個外顯子和14個內(nèi)含子，cDNA序列為1 617 bp，共編碼539個氨基酸[5～7]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對Nramp1基因的抗病性研究作了大量工作。Hu[8]對雞Nramp1基因與沙門氏傷寒菌感染的關(guān)系進(jìn)行了研究，在一個易感系雞Nramp1基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)特異的Arg223→Gln223突變。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，雞Nramp1基因高度保守區(qū)的SNP多態(tài)性與青年雞腸炎沙門氏菌疫苗接種及病原攻擊后的免疫應(yīng)答相關(guān)。羅文華[6]研究發(fā)現(xiàn)豬Nramp1基因的第6內(nèi)含子存在多態(tài)性位點，吳宏梅等[10]在大白豬和松遼黑豬中證實了該多態(tài)位點，并發(fā)現(xiàn)該多態(tài)位點與豬中性粒細(xì)胞還原力和單核細(xì)胞的細(xì)胞毒作用百分率間存在顯著相關(guān)，認(rèn)為Nramp1基因可作為豬抗病力性狀的一個主要候選基因。本研究以長白豬、大白豬和杜洛克豬3個外種豬為試驗材料，檢測Nramp1基因第6內(nèi)含子PCR-RFLPs多態(tài)性，并進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，為標(biāo)記輔助抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場核心群種豬共51頭種豬為試驗材料，其中杜洛克種豬10頭(5公5母)，長白豬24頭(7公17母)，大白豬17頭(6公11母)。耳號鉗采集豬只耳組織約200 g，放置于盛有70%乙醇的離心管中，-70 ℃保存待用。標(biāo)記樣品號和記錄豬只耳號。

1.2 基因組DNA提取及引物設(shè)計

參照文獻(xiàn)[11]提取耳組織基因組DNA，-20 ℃保存。采用吳宏梅等[10]的引物：上游引物，5’-GCC AGC TTC CAC AGT CTC CAG-3’；下游引物，5’-GGG GGT ACA AAG GGG AAG AAG-3’，擴(kuò)增片段483 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 目的片段PCR擴(kuò)增及酶切鑒定

PCR反應(yīng)體系：模板DNA 100 ng，10×buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.25 μL，Taq DNA聚合酶1 U，加ddH2O至25 μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

RFLP酶切分析：酶切體系中10×buffer(with BSA)1 μL，PCR產(chǎn)物2 μL，NdeⅠ1 μL，加ddH2O至10 μL，37 ℃恒溫水浴孵育16 h。2%瓊脂糖凝膠檢測酶切產(chǎn)物，記錄個體基因型。

1.4 群體遺傳學(xué)分析

采用POPGEN32軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、基因位點雜合度(HE)和多態(tài)信息含量(PIC)，群體Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗(df=2)。

M為DL2000 DNA marker；1～9為483 bp特異性PCR產(chǎn)物圖1 Nramp1基因第6內(nèi)含子特異性PCR產(chǎn)物Figure 1 PCR products of intron 6 in Nramp1 gene

M為DL2000 DNA marker；27～35為AB基因型；36為BB基因型圖2 Nramp1基因第6內(nèi)含子NdeⅠ酶切結(jié)果Figure 2 NdeⅠ restriction results of intron 6 in Nramp1 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

對整個試驗豬群的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，獲得與目標(biāo)片段大小一致的產(chǎn)物，且產(chǎn)物條帶清晰無雜帶、穩(wěn)定性和特異性好，可直接用于酶切分析(圖1)。

2.2 PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分型。當(dāng)酶切位點存在時，NdeⅠ內(nèi)切酶可特異性地將483 bp片段分成373 bp和110 bp 2個片段，從而產(chǎn)生AA基因型(483 bp)，BB基因型(373 bp、110 bp)和AB基因型(483 bp、373 bp、110 bp)。本研究中未檢測到AA基因型(圖2)。

2.3 3個外種豬群Nramp1基因群體遺傳學(xué)分析結(jié)果

3個外種豬群Nramp1基因頻率和等位基因頻率結(jié)果以及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結(jié)果見表1。從表1可以看出，3個豬群優(yōu)勢基因型均為AB基因型，其中杜洛克AB基因型頻率為0.900 0，BB基因型頻率為0.100 0；長白豬所有個體均為AB基因型，基因型頻率為1；大白豬AB基因型頻率為0.882 4，BB基因型頻率為0.117 6。3個豬群A、B等位基因頻率非常接近，呈均勻分布。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結(jié)果表明，3個外種豬群Nramp1基因處于遺傳不平衡狀態(tài)(Plt;0.01)，說明對于3個外種豬群體而言，Nramp1基因可能控制的抗病性狀已經(jīng)被人為有意識和無意識地進(jìn)行了選擇，遺傳平衡被打破。

表1 3個外種豬群Nramp1基因頻率和基因型頻率Table 1 Allelic and genotypic frequency of Nramp1 gene in three foreign pig herds

表2 3個外種豬群Nramp1基因多態(tài)性分析結(jié)果Table 2 Polymorphism of Nramp1 gene in three foreign pig herds

3個外種豬群Nramp1基因多態(tài)性分析結(jié)果見表2。除純合度、雜合度能反映群體的遺傳變異外，衡量群體一個位點的遺傳變異指標(biāo)還有多態(tài)信息含量(PIC)。對于一個群體而言，PIC值高、等位基因數(shù)目多、雜合度大，則該位點的遺傳變異性就高，有較大的選擇潛力；反之則說明該群體雜合度小、基因純合度高，可以看作是純系加以利用。從表中結(jié)果可以看出，就Nramp1基因位點而言，3個外種豬群雜合度高、純合度低。因0.2lt;PIClt;0.5為中度多態(tài)，故可在后續(xù)選育方案中實施中等強(qiáng)度的選擇，也可實施分化選育，即通過AB個體間交配，逐步選留純合的AA和BB個體，為抗病育種培育更多的素材。

3 討論

畜禽抗病性狀是一個復(fù)雜的閾性狀，受到遺傳和環(huán)境因素的共同影響，常規(guī)的表型選擇難以獲得理想的改良效果。利用標(biāo)記輔助育種(Marker-assistant Breeding，MAB)可以有效解決這個難題，前提是找到與抗病性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記。Nramp1基因是天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因(Nramp)家族成員，被認(rèn)為是控制動物抗病力性狀的候選基因。本研究采用PCR-RFLP技術(shù)對杜洛克、長白豬和大白豬3個外種豬Nramp1基因第6內(nèi)含子序列多態(tài)性進(jìn)行了檢測分析，共檢測到AB和BB兩種基因型，其中AB基因型占絕對優(yōu)勢，BB基因型僅有3例，未檢測到AA基因型，這與羅華文、吳宏梅等[6,10]的研究結(jié)果一致。3個群體Nramp1基因位點均處于遺傳不平衡狀態(tài)，可能與樣本含量較小有關(guān)，也可能因為AA基因型為不利基因型，在長期的有意識和無意識的選擇過程中，AA個體被逐漸淘汰，群體該位點的遺傳平衡從而被打破。

多態(tài)性分析結(jié)果顯示，3個外種豬群Nramp1基因位點雜合度都很高，其中杜洛克豬雜合度為0.900 0，大白豬雜合度為0.882 4，而長白豬雜合度為1。多態(tài)信息含量為中度多態(tài)，具有繼續(xù)選擇培育的潛力。特別是通過AB基因型個體間的交配，生產(chǎn)AA基因型和BB基因型純合子，并培育成純系，為抗病育種提供良好的遺傳素材。

本研究的多態(tài)位點位于Nramp1基因的第6內(nèi)含子內(nèi)，若該位點的突變會對豬的抗病力產(chǎn)生任何影響，則更多的可能是，突變位點發(fā)揮了順式作用，即通過突變改變核酸分子的高級構(gòu)象，從而影響Nramp1基因的轉(zhuǎn)錄，或影響轉(zhuǎn)錄后的內(nèi)含子剪接，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成和動物的疾病抵抗力。這需要后續(xù)更大群體的分子生物學(xué)檢測以及基因多態(tài)下與抗病、免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析。

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2009-09-10

楊 軍(1978-)，男，四川閬中人，農(nóng)學(xué)博士，講師，主要從事動物遺傳育種與遺傳資源保護(hù).

王家圣，E-mail: hbszh1962@163.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.012

Q346+.5;S828

A

1673-1409(2009)04-S040-04