李真順，姜 源

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

乳酸鏈球菌最適抑菌培養(yǎng)條件的研究

李真順，姜 源

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

為降低天然防腐劑乳酸鏈球菌素(Nisin)的生產(chǎn)成本，以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌，探討了直接利用乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)培養(yǎng)液進(jìn)行抑菌的最適培養(yǎng)條件。首先通過單因素試驗(yàn)，初步確定了最適碳源、氮源、金屬離子及其濃度或配比的范圍，然后采用正交試驗(yàn)L9(33)優(yōu)化后得到的乳酸鏈球菌抑菌的最佳發(fā)酵條件為：3.0 g/100 g葡萄糖，4 g/100 g蛋白胨，2 g/100 g酵母膏，1 g/100 g牛肉膏，0.005 mol/L MgSO4。優(yōu)化后的培養(yǎng)基抑菌能力明顯提高，此結(jié)果可為乳酸鏈球菌素的生產(chǎn)提供參考。

乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)；抑菌條件；營養(yǎng)要求

乳酸鏈球菌素(Nisin)能夠抑制大部分革蘭陽性菌及其芽孢的生長與繁殖， 特別是對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯，是世界上公認(rèn)的安全防腐劑。同化學(xué)防腐劑相比，乳酸鏈球菌素作為一種純天然生物防腐劑具有許多優(yōu)點(diǎn)，它安全無毒、抑菌菌譜范圍廣。雖然從開發(fā)到使用已有50年的歷史[1]，但是仍未廣泛使用。制約Nisin應(yīng)用的主要因素有2個(gè)，一是生產(chǎn)成本太高,二是純品提取困難。目前Nisin發(fā)酵所用的培養(yǎng)基有機(jī)氮含量都比較高,這一方面增加了生產(chǎn)成本,另一方面由于培養(yǎng)基中含有較高濃度的多肽,影響了Nisin的分離提純[2]。

乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)為一種安全無毒的微生物，它可產(chǎn)生Nisin，因此可直接利用其培養(yǎng)液進(jìn)行抑菌而免去提純的工藝，在食品工業(yè)上可直接作為發(fā)酵菌株進(jìn)行生產(chǎn)。本研究以抑菌特性作為指標(biāo)，探討了獲取其對(duì)金黃色葡萄球菌最佳抑菌特性的培養(yǎng)條件，以期為直接利用乳酸鏈球菌作為防腐發(fā)酵菌株應(yīng)用到發(fā)酵食品中提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：凍干的乳酸鏈球菌10193來源于中國菌種保藏中心；脫脂乳粉為市場(chǎng)上購得的完達(dá)山牌脫脂乳粉；金黃色葡萄球菌長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。

試劑：蔗糖、葡萄糖、乳糖、Na2HPO4·12H2O、NaCl、MgSO4、KH2PO4、NaOH、無菌水均為分析純；可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、瓊脂、吐溫 80均為食用級(jí)原料。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)培養(yǎng)基制作 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基配方分別如下：

CM1培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO410 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO40.2 g/L，pH 6.8。

檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨8 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、NaCl 5 g/L、Na2HPO4·12H2O 2 g/L、吐溫80 10 mL，pH值6.8。

活化培養(yǎng)基(乳酸鏈球菌10193) ：脫脂乳12 g/100 g、葡萄0.5 g/100 g、酵母膏0.5 g/100 g。

活化培養(yǎng)基(金黃色葡萄球菌)：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[3]。

(2)發(fā)酵液預(yù)處理 用移液管移取1%乳酸鏈球菌10193于100 mL CM1培養(yǎng)基中,30 ℃ 150 r/min搖床下培養(yǎng)24 h左右。培養(yǎng)完畢后以體積百分?jǐn)?shù)為10%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，定時(shí)取樣,檢測(cè)樣液D620 nm值及pH。

將培養(yǎng)一定時(shí)間的乳酸鏈球菌10193發(fā)酵液，5 400 r/min離心12 min，除去沉淀，收集上清液，并以濾紙片法[4]測(cè)乳酸鏈球菌10193的抑菌圈平均直徑。

(3)抑菌試驗(yàn)方法 采用濾紙片法。抑菌培養(yǎng)條件為30 ℃ 24 h。

(4)乳酸鏈球菌10193培養(yǎng)基優(yōu)化的單因素試驗(yàn) 以檢測(cè)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以碳源、氮源、金屬離子、培養(yǎng)溫度為考察對(duì)象，10%的接種量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，發(fā)酵24 h后，測(cè)定其抑菌圈直徑和光密度D620 nm，從而確定各因素最佳條件，具體如下：①碳源種類對(duì)試驗(yàn)菌株生長量的影響試驗(yàn)。以蔗糖、可溶性淀粉、乳糖分別代替檢測(cè)培養(yǎng)基中的葡萄糖，添加量分別為1.5 g/100 g。②氮源種類對(duì)試驗(yàn)菌株生長量的影響試驗(yàn)。按3.0 g/100 g的比例分別在檢測(cè)培養(yǎng)基中加入蛋白胨、混合氮源(酵母膏∶蛋白胨∶牛肉膏=1∶1∶1)、酵母膏、牛肉膏、檸檬酸三氨等5種氮源。③溫度對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響試驗(yàn)。培養(yǎng)溫度設(shè)為25 、30、32、35、37 ℃。④金屬離子種類對(duì)試驗(yàn)菌株生長量的影響試驗(yàn)。檢測(cè)培養(yǎng)基中分別添加0.001 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Cu2+。

(5)正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑為主要指標(biāo)，選擇碳源、氮源和金屬離子為影響因素，確定各正交因子的水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9(33)，確定出最佳提取條件。其優(yōu)化培養(yǎng)的工藝參數(shù)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

圖1 溫度對(duì)菌株抑菌效果和生長量的影響Figure 1 Influence of temperature on bacteriostatic effects and growth

不同溫度對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的影響見圖1。由圖1可以看出，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，抑菌效果較好，并且菌數(shù)也最多。隨著溫度的升高，乳酸鏈球菌菌數(shù)逐漸降低，抑菌圈直徑也平穩(wěn)降低，這說明30 ℃為乳酸鏈球菌10193的最適生長溫度，而且菌數(shù)越多，抑菌效果越好。

2.2 碳源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

以不同碳源代替檢測(cè)培養(yǎng)基中的葡萄糖，確定不同種類碳源對(duì)乳酸鏈球菌的生長及抑菌特性的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，以葡萄糖作為碳源時(shí)乳酸鏈球菌10193生長量最大，而以蔗糖作為碳源時(shí)，其Nisin抑菌效果最好，而可溶性淀粉作為碳源時(shí)乳酸鏈球菌10193的生長量和抑菌效果均差。因此選擇葡萄糖為最佳碳源。

圖2 碳源對(duì)試驗(yàn)菌株抑菌效果和生長量的影響Figure2 Influenceofcarbonsourceonbacteriostaticeffectsandgrowth圖3 氮源對(duì)菌株抑菌效果和生長量的影響Figure3 Influenceofnitrogensourceonbacteriostaticeffectsandgrowth

圖4 金屬離子對(duì)菌株抑菌效果和生長量的影響Figure 4 Influence of metal ions on bacteriostatic effects and growth

2.3氮源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

不同氮源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，以混合氮源作為氮源時(shí)細(xì)胞生長量和抑菌效果最好，牛肉膏則相對(duì)影響最小，而當(dāng)檸檬酸三銨作為氮源時(shí)乳酸鏈球菌10193幾乎不生長。5種氮源抑菌效果的次序?yàn)椋夯旌系磄t;酵母膏gt;蛋白胨gt;牛肉膏gt;檸檬酸三銨。綜合考慮，選擇混合氮源作為乳酸鏈球菌10193細(xì)胞生長和抑菌的最佳氮源。

2.4 金屬離子對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

金屬離子對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響結(jié)果見圖4。由圖4可見，6種金屬離子產(chǎn)Nisin的抑菌效果的次序?yàn)椋篗g2+gt;Zn2+gt;K+gt;Ba2+gt;Ca2+gt; Cu2+，而細(xì)胞生長量在不同金屬離子之間的變化趨勢(shì)與抑菌效果趨勢(shì)大致相同。而以Mg2+作為金屬離子加入培養(yǎng)基時(shí)，較之其它金屬離子相比，其菌株生長量也達(dá)到最大，綜合考慮，確定Mg2+為最適金屬離子。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用正交試驗(yàn)L9(33)對(duì)不同碳源、氮源和金屬離子濃度下產(chǎn)Nisin最佳條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，3個(gè)因素的極差大小順序?yàn)椋毫蛩徭V濃度gt;混合氮源濃度配比gt;葡萄糖濃度，可見金屬離子濃度是影響Nisin產(chǎn)生和產(chǎn)量的主要因子，其次是混合氮源濃度和葡萄糖濃度。最優(yōu)的營養(yǎng)條件組合為A2B2C3。

3 小結(jié)

通過單因素試驗(yàn)，確定了最適碳源、氮源、金屬離子及其濃度或配比，分別為2.5 g/100 g葡萄糖，1 g/100 g蛋白胨+1 g/100 g酵母膏+1 g/100 g牛肉膏、0.003 mol/LMg2+。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后得到的乳酸鏈球菌10193抑菌性最佳的營養(yǎng)條件為：3.0 g/100 g葡萄糖、4 g/100 g蛋白胨、2 g/100 g酵母膏、1 g/100 g牛肉膏、0.005 mol/L MgSO4。

在試驗(yàn)過程中還進(jìn)行了酸度的測(cè)定，結(jié)果表明，產(chǎn)酸能力越強(qiáng)抑菌效果越好，乳酸鏈球菌10193產(chǎn)酸能力對(duì)抑菌效果有直接影響。

本研究可為應(yīng)用乳酸鏈球菌10193進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)Nisin提供必要的參數(shù)指標(biāo)，為今后進(jìn)行微生物型食品防腐劑的研究提供基礎(chǔ)。

[1]繆存影.天然食品防腐劑—乳酸鏈球菌素[J].中國食物與營養(yǎng)，2008，(4):30～32.

[2]焦中高，陳海昌，劉 茵.營養(yǎng)因素對(duì)乳酸乳球菌DL-203生長及其Nisin生物合成的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2003，(11): 22～24.

[3]歐陽諒. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)法[M].南昌：江西人民出版社，1980.14

[4]趙 斌,何紹紅.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：科學(xué)出版社,2004.38～40.

2009-08-31

李真順(1978-)，女，湖北荊州人，工學(xué)碩士，講師，主要從事畜產(chǎn)品加工研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.019

TQ920.1

A

1673-1409(2009)04-S065-03