章松柏 吳祖建，段永平，王 盛 林奇英，謝聯輝

(長江大學農學院，湖北 荊州 434025；福建農林大學農藥生物化學教育部重點實驗室，福建 福州 350002)(福建農林大學農藥生物化學教育部重點實驗室，福建 福州 350002)

水稻矮縮病毒基因組遺傳多樣性的初步研究

章松柏 吳祖建，段永平，王 盛 林奇英，謝聯輝

(長江大學農學院，湖北 荊州 434025；福建農林大學農藥生物化學教育部重點實驗室，福建 福州 350002)(福建農林大學農藥生物化學教育部重點實驗室，福建 福州 350002)

田間調查發(fā)現，云南、福建兩地的水稻矮縮病癥狀存在差異。生物學接種實驗排除了水稻品種引起這種差異的可能性。通過10%SDS-PAGE對福建、云南兩地的7個水稻矮縮病毒分離物基因組遺傳多樣性進行分析，結果表明基因組之間存在明顯差異，主要體現在S2、S3、S11、S12 4個基因片段上，其中S2、S3片段之間的差異與癥狀差異有地域上的一致性，推測這4個基因片段中的一個或幾個與病毒的致病性相關。

水稻矮縮病毒；遺傳多樣性；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus, RDV)是隸屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)中的植物呼腸孤病毒屬(Phytorevirus)成員[1]，主要由黑尾葉蟬(Nephotettixcincticeps)、電光葉蟬(Reciliadorsalis)和二條黑尾葉蟬(N.nigropictus)以持久方式且可經卵傳播[2～4]。該病毒引起的水稻矮縮病廣泛地分布于中國、日本及菲律賓南部等水稻產區(qū)，造成水稻嚴重減產[5]。近年來在我國福建、云南、河南等水稻產區(qū)又有局部流行的趨勢[6]。水稻矮縮病的典型癥狀是在苗期至分蘗期染病后，植株矮縮，分蘗增多，葉片濃綠、僵直，生長后期病稻不能抽穗結實，始病葉以上新葉都出現點條斑。但是在福建和云南兩省進行調查時發(fā)現，侵染RDV的水稻病株癥狀存在明顯的差別，福建病株都呈現典型的矮化癥狀，高度一般只有健株的一半，分蘗增多，其病稻不能抽穗結實，而很多采自云南的病株矮化癥狀并不明顯，能正常分蘗、抽穗和結實。

植物病毒病癥狀差異的原因往往與植物病毒基因組遺傳多樣性密切相關，而植物病毒的株系分化和分子變異在自然界中廣泛存在。由于病毒致病性的變異，往往導致品種抗性的喪失，因此，對病毒致病性分化和基因變異進行研究，是非常迫切的任務。日本學者首先發(fā)現RDV在自然條件下存在基因變異，深入研究了RDV的遺傳多樣性以及其與致病性之間的關系[7]，從而發(fā)現RDV不同株系間致病力存在很大差異。為了研究田間調查過程中發(fā)現的福建、云南水稻矮縮病病株外部癥狀差異的原因，對兩地采集的水稻矮縮病毒基因組進行了研究，以初步揭示基因組遺傳差異與外部癥狀差異的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻矮縮病代表性病株于2001～2003年采自福建福州、龍巖、松溪和云南農大、西山、祿勸、武定等地，分別編號為RDV-FZ(福州)、RDV-SX(松溪)、RDV-LY(龍巖)、RDV-ND(云南農大)、RDV-LQ(祿勸)、RDV-WD(武定)、RDV-XS(西山)，經過接種純化后，種植于防蟲網室。

介體昆蟲黑尾葉蟬采自福建省農科院水稻所無病試驗田。

水稻矮縮病感病品種為臺中1號水稻品種。

1.2 生物學接種

將采集的RDV-FZ(福州)、RDV-SX(松溪)、RDV-LY(龍巖)、RDV-ND(云南農大)、RDV-LQ(祿勸)、RDV-WD(武定)、RDV-XS(西山)等7種分離物接種到水稻矮縮病毒感病品種臺中1號水稻品種上，種植于防蟲網室，觀察發(fā)病情況。

1.3 dsRNA病毒基因組的提取

病毒基因組(dsRNA)的提取參考周雪平(1995)等[8]病株中直接提取病毒基因組的方法，略有改進。步驟如下：采集以上7種分離物具有典型癥狀的水稻病葉，液氮研磨成粉末。用2倍體積的2×STE及酚、氯仿抽提，低速離心。上清液用無水乙醇調至含量為17%，注入用含17%乙醇的1×STE平衡過的纖維素(CF-11)柱中，然后用80 mL含17%乙醇的1×STE洗脫，再用不含乙醇的1×STE洗脫，洗脫液用乙醇沉淀后真空抽干，即為RDV-dsRNA。

1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

提取的病毒dsRNA基因組加等體積2×凝膠加樣緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl、pH8.0，2%巰基乙醇，4% SDS，0.2%溴酚蘭，20%甘油)煮沸10 min，取4 μL加樣于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。采用TBE緩沖體系，165 V，16 h。EB染色或銀染觀察結果。

2 結果與分析

2.1 生物學接種結果

表1 RDV 7種分離物在原水稻品種和感病品種臺中1號的表現Table 1 The performances of original or Taizhong No.1 rice varietie inoculated by 7 RDV isolates

將采集的7種分離物接種到感病品種臺中1號上，種植于防蟲網室，觀察發(fā)病情況。結果如表1。癥狀的差異主要由兩種原因引起的：(1)病毒的基因組差異，導致致病性存在差異，從而引起自然寄主發(fā)病差異；(2)水稻品種抗病性的差異。從表1可得知，生物學接種結果符合田間調查發(fā)現，說明這種癥狀差異不是水稻品種不同所導致的，推測與病毒基因組差異相關。

2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果

RDV 福州(RDV-FZ)、松溪(RDV-SX)、龍巖(RDV-LY)、云南農大(RDV-ND)、祿勸(RDV-LQ)、武定(RDV-WD)、西山(RDV-XS)等7個地方分離物的10% SDS-PAGE電泳圖譜如圖3.4(其中A為銀染，B、C為EB染色)。圖譜顯示：福建、云南兩地的RDV7種分離物的基因組dsRNA存在明顯的遺傳多樣性，基因組差異體現在S2/S3、S11/S12 4個基因片段上，其中S2/S3之間的差異有地域性，即福建分離物和云南地方分離物在S2/S3上存在地理差異。而田間調查發(fā)現福建、云南兩省的各分離物其引起的水稻矮縮病的癥狀存在較大的差異，生物學接種實驗排除了水稻品種引起這種差異的可能性，推測與病毒基因組差異相關。暗示這4個基因片段中的一個或幾個可能與水稻的矮化癥狀相關。

RGDV,水稻瘤矮病毒；ND、LQ、WD、LY、SX、XS、FZ：水稻矮縮病毒分離物圖1 RDV分離物基因組10%聚丙烯酰胺電泳圖譜Figure 1 10% PAGE showing dsRNA profiles from some RDV isolates rice dwarf gall virus

3 討論

植物病毒的株系分化和分子變異在自然界中廣泛存在。株系分化和分子變異為病毒分類、分化和抗病育種以及病毒生物功能和機制的比較研究提供重要材料和依據。我國幅員遼闊，各地生境千差萬別，RDV分布地理跨度極大，很有可能產生新株系，引起遺傳多樣性和致病性變化。由此可見RDV遺傳多樣性研究具有重要的理論和應用意義。本研究初步分析了RDV基因組的遺傳多樣性。通過生物學接種和致病性測定首先排除水稻矮縮病癥狀差異由水稻品種導致，明確癥狀差異是有基因組差異引起的。在此基礎上對癥狀上有差異的7個病毒分離物的基因組遺傳多樣性進行了初步分析，顯示S2、S3、S11、S12存在較明顯的差異。值得注意的是，S2/S3片段之間的差異與癥狀差異具有一致的地域性。所以推測S2/S3、S11/S12這4個基因片段中的某一個或多個片段與病毒致病性有一定的關系。這種推測與報道中的一些推測相符合[9～11]。因此，這4個基因片段中的一個或幾個可能與水稻的矮化癥狀相關，值得進一步研究。進一步研究的重點可放在S2/S3、S11/S12這4個差異基因片段的核酸序列分析和比較上，找出可能與致病性相關的基因片段，在此基礎上進行分子間互作研究。

[1]van Regenmortel M H V,Fauquet C M,Bishop D H L.Taxonomy,classification and nomenclature of viruses: Seventh report of the international committee on taxonomy of viruses [M].New York,San Diege: Academic Press,2000.622～627.

[2]林奇英，謝聯輝．傳帶水稻矮縮病毒的二點黑點葉蟬[J]．福建農業(yè)科技，1982，(3)：24～25．

[3]Lin Q Y,Xie L H.A new insect vector of Rice dwarf virus[J].IRRN,1981,6(5):14.

[4]陳聲祥．水稻病毒病發(fā)生現狀及研究進展[J]．浙江農業(yè)科學，1996，(1)：41～42．

[5]謝聯輝，林奇英．中國水稻病蟲綜合防治進展[M]．杭州：浙江科學技術出版社，1988．255～264

[6]喬玉昌,王 陽，黃雅柯,等.水稻矮縮病毒病及其防治[J].湖北農業(yè)科學,2003,(1):12.

[7]Uyeda I,Ando Y,Murao K,etal.High resolution genome typing and genomic reassortment events of rice dwarf phytoreovirus[J].Virology,1995,212:724～727.

[8]周雪平，李德葆．雙鏈RNA技術在植物病毒研究中的應用[J]．生物技術,1995,5 (1):1～4．

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[10]Tomaru M,Maruyama W,Kikuchi A,etal.The loss of outer capsid protein P2 results in nontransmissibility by the insect vector of rice dwarf phytoreovirus[J].Jounal of Virology,1997,71:8019～8023.

[11]Chen D Y,Patton J T.Rotavirus RNA Replication Requires a Single-Stranded 3` End for Efficient Minus-Strand Synthesis[J].Jounal of Virology,1998,72:7387～7396.

2009-08-31

國家自然科學基金項目(39900091)

章松柏(1978-)，男，湖北黃梅人，農學碩士，講師，主要研究方向為分子植物病毒學.

吳祖建，E-mail:zujianwu@126.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.011

Q346+.5

A

1673-1409(2009)04-S037-03