鄧波濤　趙　斐　王學英

摘要 通過對胡蘿卜SRAP反應體系中Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度以及模板DNA濃度的優(yōu)化,結(jié)果表明,在20μL反應體系中,DNA模板最適濃度為3.00ng/mL,Mg2+最適濃度為2.25mmoL/L,引物最適濃度為0.30μmoL/L,dNTPs最適濃度為0.20 mmoL/L。

關(guān)鍵詞 胡蘿卜;SRAP;體系優(yōu)化

中圖分類號 S631.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739(2009)13-0082-03

我國胡蘿卜的研究起步較晚,基礎相對薄弱。由于對胡蘿卜分子標記的開發(fā)不足,目前多采用RAPD分子標記技術(shù)進行遺傳多樣性分析[1]。SRAP(Sequence-related amplified polymorphism,相關(guān)序列擴增多態(tài)性)分子標記是一種新型的、基于PCR的標記技術(shù),具有其獨特的引物設計,上游引物長17bp,對外顯子進行特異擴增,下游引物長18bp,對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異擴增[2]。SRAP標記技術(shù)具有重復性好、多態(tài)性高等特點,目前已廣泛應用于蔬菜作物的遺傳多樣性分析及遺傳圖譜的構(gòu)建[3-5],但是目前還未見胡蘿卜的SRAP報道。PCR中模板DNA濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度以及引物濃度等因素均會對SRAP結(jié)果產(chǎn)生影響,本研究擬通過建立胡蘿卜SRAP-PCR反應體系并對其進行優(yōu)化,為新型分子標記技術(shù)SRAP在胡蘿卜分子研究中的應用打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為胡蘿卜HCM A.C.,由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所胡蘿卜課題組提供。2007年9月,種植于溫室中,7片葉時,取葉提取DNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取及SRAP分析。DNA的提取采用CTAB法,并加以改進。SRAP擴增程序參照Li和Quiros(2001)的程序,即:94℃預變性3min;94℃變性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5個循環(huán);94℃變性1min;50℃退火1min;72℃延伸1min,35個循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。擴增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒壓160V,電泳時間2.5h左右,電泳后銀染分析。

1.2.2 Mg2+濃度的優(yōu)化。以HCM A.C.的基因組DNA為模板,設置3種Mg2+濃度,即在20μL體系中,Mg2+摩爾濃度分別為1.50mmoL/L、2.25mmoL/L、3.00mmoL/L,以CuMe8和CoEm13為引物進行SRAP-PCR擴增。

1.2.3 dNTPs濃度的優(yōu)化。以HCM A.C.的基因組DNA為模板,設置2種dNTPs濃度,即在20μL體系中,dNTPs摩爾濃度分別為0.15mmoL/L、0.20mmoL/L,以CuMe8和CoEm13為引物進行SRAP-PCR擴增。

1.2.4 引物濃度的優(yōu)化。以HCM A.C.的基因組DNA為模板,設置3種引物濃度,即在20μL體系中,模板摩爾濃度分別為0.20μmoL/L、0.30μmoL/L、0.40μmoL/L,以CuMe8和CoEm13為引物進行SRAP-PCR擴增。

1.2.5 模板DNA濃度的優(yōu)化。以HCM A.C.的基因組DNA為模板,設置8種模板濃度,即在20μL體系中,模板質(zhì)量-體積濃度分別為0.50ng/μL、0.75ng/μL、1.00ng/μL、1.50 ng/μL、2.50 ng/μL、3.00ng/μL、4.00ng/μL、5.00ng/μL,以Me1和Em6為引物進行SRAP-PCR擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mg2+濃度的影響

Mg2+是Taq酶的激活劑,因此Mg2+對PCR反應的特異性和擴增效果影響顯著。Mg2+濃度低時,PCR反應產(chǎn)物的條帶少,而且不清晰;Mg2+濃度高時,PCR反應產(chǎn)物的條帶較多,但是易產(chǎn)生非特異條帶。從擴增效果來看,Mg2+濃度為2.25mmoL/L時,SRAP條帶豐富,而且清晰穩(wěn)定。

2.2 dNTPs濃度的影響

dNTPs是PCR反應的底物,但是它與Taq酶競爭Mg2+,dNTPs的濃度低時,會影響PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量;而dNTPs的濃度高時,會與Taq酶競爭Mg2+,從而影響PCR的反應。當dNTPs濃度為0.15mmoL/L時,擴增產(chǎn)物量較少,條帶不清晰;當dNTPs濃度為0.20mmoL/L時,擴增產(chǎn)物條帶清晰。因此,選擇0.20mmoL/L為dNTPs的最佳濃度。

2.3 引物濃度的影響

引物負責與模板DNA的結(jié)合,直接影響PCR反應的效率。引物濃度低時,與模板DNA的結(jié)合效率低,會影響PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量;引物濃度高時,容易形成引物二聚體,影響PCR反應結(jié)果。引物濃度為0.20 μmoL/L時,條帶較少;引物濃度為0.30μmoL/L和0.40 μmoL/L時,擴增結(jié)果豐富,相比之下,引物濃度為0.30 μmoL/L時清晰可見。為節(jié)約起見,選用濃度0.30μmoL/L為最佳引物濃度。

2.4 模板DNA濃度的影響

DNA模板濃度對SRAP反應的影響結(jié)果不大,DNA濃度從10～100ng,都能擴出產(chǎn)物,可見SRAP對DNA濃度的條件較寬。但是DNA濃度小于1.50 ng/μL時,擴增結(jié)果條帶少,而且不清晰;DNA濃度大于1.50 ng/μL時,擴增結(jié)果清晰可見。參考其他作物的SRAP體系對DNA濃度的要求[6],選擇3.00ng/μL為最佳模板濃度。

3 結(jié)論與討論

SRAP分子標記技術(shù)是由美國加州大學Li和Quiros博士于2001年提出,又叫基于序列擴增多態(tài)性(Sequence-based amplified polymorphism,SBAP),具有簡單、高效、高共顯性、重復性、易測序等優(yōu)點,適合應用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與克隆、比較基因組學、遺傳多樣性分析等研究領域[7-11]。目前已經(jīng)在油菜、馬鈴薯、蘋果、柑橘、櫻桃、梅子、大蒜、萵苣、芹菜、棉花、小麥、辣椒等植物研究中應用。

試驗以胡蘿卜基因組DNA為模板,對胡蘿卜SRAP-PCR的反應參數(shù)(Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度和模板濃度)進行逐級優(yōu)化。胡蘿卜SRAP-PCR反應體系對Mg2+濃度較為敏感,Mg2+濃度低時,擴增條帶少而且不清晰,Mg2+濃度高時,容易產(chǎn)生非特異擴增;對dNTPs和引物濃度的要求與其他PCR的要求一致;SRAP-PCR的前5個循環(huán)的退火溫度為35℃,有利于引物和模板結(jié)合,增加模板量,因此對DNA濃度的要求較寬[12],但是DNA濃度低會影響擴增結(jié)果。胡蘿卜SRAP-PCR最佳反應體系為:在20μL反應體系中,DNA模板最適濃度為3.00ng/mL,Mg2+最適濃度為2.25mmoL/L,引物最適濃度為0.30μmoL/L,dNTPs最適濃度為0.20 mmoL/L,不足部分用ddH2O補足。此反應體系擴增結(jié)果穩(wěn)定,條帶豐富而且清晰。胡蘿卜SRAP體系的建立與優(yōu)化為胡蘿卜遺傳圖譜的構(gòu)建打下了基礎。

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