王繼華　劉　垠　何永靜　杜永貴　趙亞南

[摘要]目的：探討轉(zhuǎn)化生長因子-β₁（tansforming gowth factor -beta 1，TGF-β₁）對長波紫外線（ultraviolet A， UVA）照射皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成和表達(dá)的影響。 方法：通過MTT法檢測TGF-β₁干預(yù)后成纖維細(xì)胞增殖活性，選擇UVA照射劑量為15J/cm²， 聯(lián)免疫法（ELISA）測定不同劑量即TGF-β₁小劑量組（UVA+TGF-β₁0.1ng/ml）、中劑量組（UVA+TGF-β₁1ng/ml）、大劑量組（UVA+TGF-β₁10ng/ml）處理后成纖維細(xì)胞清夜中Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量，半定量RT－PCR檢測成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)。結(jié)果：UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖活性下降， 給予不同劑量TGF-β₁干預(yù)后，成纖維細(xì)胞增殖活性與UVA照射組比較，明顯提高；成纖維細(xì)胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量增加，成纖維細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增強(qiáng)。 結(jié)論：TGF-β₁可提高UVA照射體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖活性；增加UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)，對皮膚成纖維細(xì)胞起保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]TGF-β₁；UVA；皮膚成纖維細(xì)胞；Ⅰ型、Ⅲ型膠原

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0338-04

The effects of TGF-β₁on the synthesis and expression of Ⅰ，Ⅲ collagen in skin fibroblasts after UVA irradiation in vitro

WANG Ji-hua,LIU Yin,HE Yong-jing，DU Yong-gui，ZHAO Ya-nan

（Department of Plastic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming,650101,Yunnan）

Abstract: Objective To investigate the effects of TGF-β₁on the synthesis and expression of Ⅰ,Ⅲ collagen in skin fibroblasts after UVA irradiation in vitro. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） was used to test cell proliferation activity,and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the content of Ⅰ,Ⅲ collagen in the supernatant of skin fibroblasts after adding different dose of TGF-β₁( low dose 0.1 ng / ml,medium dose1.0 ng / ml、 high dose 10.0 ng / ml) and the fibroblasts were irradiated by UVA15 J/cm². The mRNA expression of Ⅰ,Ⅲ collagen by semi-quantitative( RT-PCR) Results UVA irradiation decreasesed the fibroblasts OD value.The fibroblasts OD value was markedly increased,compared to UVA irradiation group. With the dose of TGF-β₁increased，the experiment showed that large, and medium dose group OD values were markedly higher than that of the UVA irradiation group. Ⅰ,Ⅲ collagen protein content increased with the dose of TGF-β₁increased ，and the mRNA expression of Ⅰ,Ⅲ collagen also increased in a dose-dependent manner. Conclusion TGF-β₁treatment before UVA irradiation can improve skin fibroblasts proliferation activity in vitro. It is in a dose-dependent manner to promote the synthesis and the expression mRNA of collagen Ⅰ,Ⅲ on UVA irradiated fibroblasts .It help protect skin fibroblasts from irradiation.

Key words: tansforming gowth factor -beta 1; ultraviolet A; skin fibroblast ; Ⅰ,Ⅲ collagen

人體皮膚接受的日光紫外線（UV）照射主要為UVA和UVB。UVA能穿透表皮到達(dá)真皮，主要造成皮膚成纖維細(xì)胞損傷，而UVB在表皮層被阻擋，很少到達(dá)真皮層，主要造成表皮角質(zhì)形成細(xì)胞損傷。真皮構(gòu)成皮膚的主體，通過動物光老化模型和人體皮膚檢測證明，皮膚反復(fù)暴露UV下，Ⅰ、Ⅲ型前膠原合成減少，真皮膠原降解，膠原分子交聯(lián)，導(dǎo)致膠原數(shù)量的減少和結(jié)構(gòu)的改變，加上異常彈力纖維沉積，出現(xiàn)皮膚松弛，粗糙，色素沉積、彈性下降，皺紋增多的光老化外觀。有文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，UV能誘導(dǎo)Smad7在皮膚內(nèi)表達(dá)，阻礙TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路， 在皮膚成纖維細(xì)胞，TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路受阻，可導(dǎo)致Ⅰ型前膠原合成減少，造成膠原喪失。Gambichler 等[3]用UVA照射正常人皮膚24h后，組織內(nèi)TGF-β₁和Smad3/4/7與未照射部位比較明顯下調(diào)。本研究通過體外培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞，用UVA照射建立成纖維細(xì)胞光老化模型，探討TGF-β₁對UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成和表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1 主要儀器：UVA 光源(北京光學(xué)儀器廠)，紫外線輻照計(jì)（北京師范大學(xué)），Clinibio 128C 型酶標(biāo)儀(ASYS HitechGmbH,奧地利)，PCR儀( Perkin Elmer公司,美國)，紫外分光光度計(jì) U－niversal Hood Ⅱ型紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,意大利) 。

1.2 主要試劑：DMEM，小牛血清，青霉素，鏈霉素，胰酶， Trizol試劑(MRC,美國)；AMV－逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶( Promega,美國)；及內(nèi)參照β-acting引物；MMP-1,MMP-3，TGF-β₁、Ⅰ型、Ⅲ型膠原引物。Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β₁ELISA試劑盒( TP I,美國) 。

1.3 皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代：所用的皮膚取自20～23歲成年男性包皮環(huán)切術(shù)后的皮膚組織,共6 例，術(shù)前檢查均無結(jié)締組織疾病及其他全身系統(tǒng)疾病。利用組織塊培養(yǎng)法,加入含20%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液,1周后成纖維細(xì)胞爬出。待融合80%后常規(guī)消化傳代,取第5代對數(shù)增殖期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.4 不同濃度TGF-β₁干預(yù) UVA照射體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞：將細(xì)胞接種在6 孔板上,濃度為1×105/ml，以UVA15J/ cm²照射成纖維細(xì)胞。細(xì)胞分為5組，即正常對照組（對照組不照射也不加入TGF-β₁，只加入等量PBS）、UVA單純照射組（TGF-β₁0ng/ml）、小劑量組（UVA+TGF-β₁0.1ng/ml）、中劑量組（UVA+TGF-β₁1ng/ml）、大劑量組（UVA+TGF-β₁10.0 ng/ml）。UVA紫外燈選用北京光學(xué)儀器廠UVA360nm燈管6根并排照射，先將紫外線燈管消毒后置入超凈臺中，HH-S恒溫水浴箱嚴(yán)格消毒后加入三蒸水置入超凈臺中，用超凈臺紫外燈消毒30min。照射前將長波紫外燈置于恒溫水浴箱上，測量燈管與96孔板照射平面之間距離為12cm，用北京師范大學(xué)光電儀器廠紫外輻照計(jì)測量此平面UVA照射功率，測量前長波紫外燈預(yù)熱30min，待照射功率穩(wěn)定后測得功率為18.8mJ/s,照射時(shí)以PBS置換培養(yǎng)基，掀開蓋子，在恒溫水浴箱中將細(xì)胞暴露于UVA輻照裝置下，照射距離為12cm。照射前2h加入含不同濃度TGF-β₁、PBS液各3ml，培養(yǎng)板置入37℃恒溫水浴箱中，照射后置換含10%小牛血清的DMEM置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),24h 后收樣。

1.5MTT法檢測TGF-β₁干預(yù)后成纖維細(xì)胞增殖活性：用含10％胎小牛血清加培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200μl，培養(yǎng)1天后，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解，選擇492nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1.6ELISA檢測TGF-β₁對UVA照射體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量的影響：收集細(xì)胞上清液標(biāo)本：①建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔設(shè)3復(fù)孔，每個(gè)孔中各加入標(biāo)本稀釋液100μl，第一孔加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，混勻后用加樣器吸出100μl，移至第二孔，如此反復(fù)作倍數(shù)稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100μl 棄去，使之體積均為100μl，第八孔為空白對照；②加樣：待測品孔每孔各加入待測樣品100μl，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔；③將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120min；④洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干；⑤每孔中加入第一抗體工作液50μl；⑥將反應(yīng)板置37℃60min；⑦ 洗板：同前；⑧每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μl；⑨將反應(yīng)板置37℃60min；⑩洗板：同前；⑾每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗處反應(yīng)5～10min；⑿每孔加入50μl終止液混勻；⒀在492nm處測吸光值。

1.7 半定量RT－PCR檢測TGF-β₁對UVA照射體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平的影響： RNA提取，半定量RT－PCR分析：用磷酸緩沖液(PBS) 洗三次,使用Trizol 提取RNA。首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取10μg RNA 加入到20μl 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液中,經(jīng)94℃ 30min,99℃ 5min 和5℃ 5min 處理。在含有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR 反應(yīng)液中, 分別加入：

Ⅰ型膠原引物 (285bp)

上游引物 5′-GGT TTG GAG AGG CAT GAC C-3′

下游引物 5′-TTT GGG AAA TTG AGT TTG G-3′

Ⅲ型膠原引物(447bp)

上游引物 5′－ATG GTG GCT TTC AGT TCA CC-3′

下游引物 5′-TGG GGT TTC AGA GAG TTT GG -3′

Β-acting做內(nèi)參照引物(510bp)

上游引物 5′-GCA CTC TTC CAG CCT TTC CTG-3′

下游引物 5′－GGA GTA CTT GCG CTC AGG AGG AGC-3′

PCR 反應(yīng)體積為25μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃6min,接著94℃50s,55℃50s,72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)后72℃7min延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描成像擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 ：數(shù)據(jù)以(x±s)表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對組間數(shù)據(jù)行單因素方差分析，P<0.05有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 TGF-β₁對成纖維細(xì)胞增殖活性的影響：選擇UVA 15 J/cm²照射前給予不同劑量TGF-β₁干預(yù)后，結(jié)果顯示：正常對照組成纖維細(xì)胞OD值明顯高于UVA 照射組，有非常顯著性差異（P＜0.01）；TGF-β₁處理后，隨著TGF-β₁劑量增加，OD值升高，大、中劑量組OD值與UVA 照射組比較，有非常顯著性差異（P＜0.01）（表1）。

2.2 TGF-β₁對成纖維細(xì)胞細(xì)胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量的影響：正常對照組Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量明顯高于UVA照射組，有非常顯著性差異(P<0.01)。TGF-β₁處理后，隨著TGF-β₁劑量增加，Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量升高，呈劑量依賴關(guān)系。大劑量組、中劑量組與UVA照射組比較，有顯著性差異(P<0.01，P<0.05),大劑量組對UVA照射保護(hù)作用更明顯，與UVA照射組比較，有非常顯著性差異(P<0.01),小劑量組處理后Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量無顯著性差異（P＞0.05）(表2)。

2.3 TGF-β₁對成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響： 正常對照組Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)與UVA照射組比較，有非常顯著性差異(P<0.01)。TGF-β₁處理后，隨著TGF-β₁劑量增加，Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增強(qiáng)，呈劑量依賴關(guān)系。Ⅰ型膠原,大、中劑量組明顯升高，與UVA照射組比較，有非常顯著性差異（P<0.01），小劑量組與UVA照射組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。Ⅲ型膠原,大劑量組與UVA照射組比較，有非常顯著性差異（P<0.01），中、小劑量組與UVA照射組比較,Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）。（表3，圖1，圖2）

3討論

3.1轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）是一大類多功能的細(xì)胞生長增殖調(diào)節(jié)蛋白，由Todaro等于1978年首次發(fā)現(xiàn)。TGF-β家族中至少有6個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子組成，其中TGF-β₁,TGF-β2,TGF-β3較多見，存在于大多數(shù)哺乳動物，具有極高的同源性，氨基酸的序列在不同類別的哺乳動物間高度保守，TGF-β₁在體細(xì)胞系中所占比例最高(>90%),活性最強(qiáng)，TGF-β₁作用范圍也十分廣泛。TGF-β₁還是一種潛在的表皮生長抑制劑，對維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。然而，對真皮是正向生長因子，能誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成[4]。Gambichler[5]對暴露于UVA 24h后的皮膚進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)TGF-β₁mRNA和 Smad3/4/7 mRNA表達(dá)與未照射組比較明顯下調(diào),免疫組化顯示成纖維細(xì)胞中TGF-β₁蛋白水平明顯減少，說明TGF-β₁的表達(dá)和TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路，在皮膚老化和UV照射導(dǎo)致的皮膚光老化發(fā)生過程中有著重要的作用。研究表明，全反式維甲酸能增加光老化皮膚Ⅰ型前膠原的表達(dá)，可能是因?yàn)門GF-β活性和表達(dá)增加[6-7]。 Eui[8]將17β雌二醇用于老年人皮膚，檢測發(fā)現(xiàn) TGF-β₁, TβR-II,和Smad3增加，Ⅰ型前膠原、彈力蛋白原、纖維結(jié)合蛋白-1上調(diào)，而MMP-1表達(dá)下降，也證明17β雌二醇促進(jìn)膠原的合成與TGF-β₁的表達(dá)和TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路有重要關(guān)系。TGF-β₁是否能促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成，未見這方面的報(bào)道。

3.2 本研究通過體外培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞，用TGF-β₁處理后以UVA15J/cm²照射建立成纖維細(xì)胞光老化模型，細(xì)胞增殖活性測定結(jié)果顯示：隨TGF-β₁劑量增加，成纖維細(xì)胞OD值升高，說明TGF-β₁能明顯提高UVA照射成纖維細(xì)胞的增殖活性。Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量，隨著TGF-β₁劑量增加而增加，呈劑量依賴關(guān)系，說明加入TGF-β能促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原合成，增加細(xì)胞外基質(zhì)。與UVA照射組比較，在大劑量組（10 ng/ml）、中劑量組（1ng/ml）明顯增強(qiáng)Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)，而Ⅲ型膠原mRNA表達(dá),大劑量組（10ng/ml）時(shí)明顯增強(qiáng)。

3.3 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， UV能下調(diào)成纖維細(xì)胞TβR-Ⅱ?qū)GF-β的效應(yīng)能力，干擾TGF-β依賴的Ⅰ型前膠原基因表達(dá)[9-10]。煙草煙霧提取物處理體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，能減少TβR-Ⅱ表達(dá)，但處理前加入重組TGF-β₁（10ng/ml），TβR-Ⅱ mRNA表達(dá)增加[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)加入TGF－β₁后Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成增加，推測可能是因?yàn)榧尤隩GF-β₁后，TβR-ⅡmRNA表達(dá)增加，增強(qiáng)了TβR-Ⅱ?qū)GF-β的效應(yīng)能力，促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原合成。

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[收稿日期]2008-09-26 [修回日期]2009-01-19

編輯/張惠娟