劉文忠　陳志剛　孫同柱　付小兵

[摘要]目的：觀察大鼠深Ⅱ度燙傷模型創(chuàng)面愈合中血管形成與血流改變的特點。方法：Wistar大鼠48只，隨機分為A、B兩組，A組（n=42）：為組織病理觀察組，根據實驗設計又分傷后即刻、1天、3天、7天、14天及21天及正常對照組，每組6只；B組（n=6）：為血流量檢測組。在實驗大鼠背部制作深Ⅱ度燙傷模型，A組大鼠在各時間點活殺取材，進行病理和免疫組化檢測；B組大鼠連續(xù)檢測背部同一部位正常皮膚及傷后各時間點的創(chuàng)面血流量。結果：燙傷大鼠傷后3～7 天，肉芽組織內出現單個的不成腔的血管內皮細胞，數目隨肉芽組織的增多而逐漸增加，后逐漸形成管腔；傷后14 天，肉芽組織內有腔毛細血管進一步增多，已出現結構較完整的成熟小血管；傷后21 天血管形態(tài)和數量已接近正常皮膚。深Ⅱ度燙傷大鼠傷后即刻，皮膚血流量銳減為正常皮膚血流量的51%；傷后3 天時，創(chuàng)面血流量僅達正常血流量的68%；至傷后14 天，創(chuàng)面血流量升到正常值的88%；14 天后逐漸正常。結論：在皮膚深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過程中，隨著肉芽組織內內皮細胞數量和結構的變化，創(chuàng)面的血流量不斷增加，前者的變化是后者變化的基礎。

[關鍵詞]燙傷；創(chuàng)面愈合；血管；內皮細胞

[中圖分類號]R622.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0328-04

Changes of blood flow and formation of blood vessels during wound healing after deep Ⅱ degree scald in rats

LIU Wen-zhong1,CHEN Zhi-gang2,SUN Tong-zhu3,FU Xiao-bing3

（1.Department of Anatomy,Medical College of Inner Mongolia, Hohhot 010059, Inner Mongolia,China; 2. Department of Urologic Surgery,Beijing General Hospital of Aerospace,Beijing 100076,China; 3 Institute of wound healing,First clinical hospital of China PLA General Hospital,Beijing 100037,China）

Abstract: Objective To explore the relationship between blood flow and formation of blood vessels during wound healing process after deep Ⅱ degree scald injury in rats. Methods 48 Wistar rats were randomly divided into pathological observing group (group A, 42 rats) and blood flow detecting group (group B, 6 rats). Group A was further divided into 6 subgroups according to the postburn period, which were immediately after scald, 1, 3, 7, 14 and 21 days after scald and normal control. Deep Ⅱ degree scald in rats was made on either side of back by using a metal scald machine. Rats in group A were sacrificed at different time points and specimens were collected for pathological and immunohistochemistry observation. Rats in group B were kept alive for detecting blood flow at the same position of the wound at different time points. Results Single endothelial cell was observed and increased to form the cavity from 3 to 7 days after injury, the endothelial cell numbers increased in accordance with the formation of granulation tissues. 14 days after injury, blood capillary with cavums in granulation tissues increased and even mature small vessels with intact structures were found. The shape and numbers of blood vessels were near to normal after 21 days. Blood flow decreased dramatically immediately after thermal injury, which was about 51% of the normal value. However, it reached to 68% after 3 days and 88% after 14 days of normal value. After 14 days, the value was almost back to normal. Conclusions During the wound healing process after deep Ⅱ degree scald injury in rats, blood flow increased gradually in accordance with the changes of endothelial cells in granulation tissues. The numbers and structure of endothelial cells affecting the changes of blood flow.

Key words: scald injury; wound healing; blood vessel; endothelial cell

血管作為人體內重要的組成部分是營養(yǎng)物質、代謝產物和一些生物活性物質的主要傳遞途徑，在損傷修復過程中的作用至關重要[1-2]。本研究利用大鼠背部皮膚深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合模型，采用免疫組化技術觀察傷后各時間點血管內皮細胞形態(tài)，并對創(chuàng)面?zhèn)蟾鲿r間點的血流量進行檢測，觀察兩者在創(chuàng)面愈合過程中的變化規(guī)律及兩者間的關系，以助于對創(chuàng)面愈合過程的認識，豐富創(chuàng)傷修復的理論，為臨床創(chuàng)面治療提供理論依據[3-4]。

1材料和方法

1.1 主要試劑和溶液：抗體FactorⅧ Related Antigen（購自Santa Cruz Biotechnology，Inc.）；二步法免疫組化檢測試劑盒（購自北京中山生物技術有限公司）。

1.2 主要儀器：圖像分析儀（瑞典）、激光多普勒血流檢測儀（美國）、激光共聚焦顯微鏡。

1.3實驗動物分組及模型制備

1.3.1 實驗動物及分組：選用健康雄性Wistar大鼠48只，體重0.22～0.25kg，購自軍事醫(yī)學科學院動物中心。將大鼠隨機分為A、B兩組，A組42只，為組織病理觀察組，根據實驗設計又分為：傷后即刻、1 天、3 天、7 天、14 天及21 天組及正常對照組，每組6只；B組6只，為血流量檢測組，連續(xù)檢測大鼠背部同一部位正常皮膚及傷后即刻、傷后1 天、3 天、7 天、14 天及21 天創(chuàng)面血流量。

1.3.2 燙傷模型制備：將大鼠用速眠新（0.1 ml、肌注）麻醉后，背部凈毛，用金屬燙傷器在背部兩側分別制做一個深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面（70℃、8s），創(chuàng)面為圓形，直徑18 mm，面積2.54 cm2。（以上致傷條件預實驗已經病理切片證實）。

1.4 標本采集與處理：A組大鼠在各時間點活殺取材（創(chuàng)面及周圍0.5cm正常皮膚），所取組織經10%福爾馬林固定后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋后，用于組織病理學、免疫組化檢測。

1.5檢測指標及方法

1.5.1大體觀察：觀察燙傷后各時間點，創(chuàng)面顏色、形狀、大小及質地的變化。

1.5.2 創(chuàng)面面積：傷后3天、7天及14天采用畫膜稱重法測量B組及A組剩余大鼠創(chuàng)面面積。用透明膜覆蓋創(chuàng)面，沿創(chuàng)緣畫膜，剪膜，置分度值為0.1mg的分析天平稱重換算成創(chuàng)面面積。

1.5.3血流量檢測：采用彩色激光多普勒血流量檢測儀，分別檢測B組大鼠背部相應部位致傷前正常皮膚及傷后即刻、傷后1 天、3 天、7 天、14 天及21 天創(chuàng)面血流量。

1.5.4病理學觀察：利用HE染色光鏡下觀察傷后各時間點創(chuàng)面肉芽組織生長及愈合的組織學特征。

1.5.5免疫組織化學檢測：檢測大鼠正常皮膚及傷后各時間點FactorⅧ 的表達。具體方法如下參見試劑盒。

1.6圖像分析：組織切片及照片均進行電腦圖像分析。

1.7統(tǒng)計學處理：各項指標均以平均值±標準差（x±s）表示，數據應用STATA（7.0版本）軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料使用F檢驗進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2結果

2.1 燙傷大鼠創(chuàng)面的大體觀察：各組大鼠燙傷即刻：創(chuàng)面蒼白，創(chuàng)緣整齊，創(chuàng)面形狀呈圓形，質地略變硬。隨后創(chuàng)緣及周圍皮膚水腫加重；傷后3天：創(chuàng)面呈圓形或橢圓形，面積變小，創(chuàng)面形成棕褐色硬痂，創(chuàng)面略凹陷，周圍正常皮膚仍有水腫反應，用畫膜稱重法測得創(chuàng)面面積為（1.94cm±0.18）cm2；傷后7天：創(chuàng)面進一步縮小、變硬，硬痂顏色加深呈深褐色，部分創(chuàng)面在創(chuàng)緣處硬痂與創(chuàng)面分離，創(chuàng)面有鮮紅色肉芽組織形成；創(chuàng)面面積為（1.18±0.25）cm2；傷后14天：絕大部分創(chuàng)面硬痂自行脫落，創(chuàng)面明顯縮小，創(chuàng)面中央殘留有小面積未愈合創(chuàng)面；創(chuàng)面面積為（0.09cm±0.07）cm2；傷后21天：全部創(chuàng)面愈合。結果參見表1。

2.2 創(chuàng)面愈合過程中微血管的變化：免疫組化及免疫熒光染色顯示：血管內皮細胞染成棕黃色或被染成紅色熒光。正常大鼠皮膚：在真皮各層次內均可見血管分布，部分血管腔內可見紅細胞充盈。在皮膚附件周圍血管密度較高，并且血管斷端口徑由淺層向深層逐漸增大；傷后1天，創(chuàng)面血管管壁增厚，周圍有炎性細胞積聚，腔內有紅細胞黏附；傷后3～7天，隨著創(chuàng)面肉芽組織的生成，肉芽組織內出現單個的不成腔的，或成簇狀的血管內皮細胞，數目隨肉芽組織的增多而逐漸增加。新形成的血管內皮細胞大多沿與創(chuàng)面垂直方向生長，形態(tài)由剛形成時單個或無腔的簇狀逐漸轉變?yōu)橛星?，進而腔內有紅細胞充盈。傷后14天，單個或無腔的簇狀內皮細胞數目減少，在較早形成的肉芽組織內創(chuàng)面有腔毛細血管進一步增多，已出現結構較完整的成熟小血管；傷后21天，血管形態(tài)和數量接近正常皮膚。結果參見圖1～4。

2.3 創(chuàng)面血流量的變化：采用瑞典產PIMⅡ型激光多普勒血流檢測儀，將6只大鼠在相同條件下，分別測量背部同一部位3cm×3cm的正方形區(qū)域（創(chuàng)面位于該區(qū)域中央）內正常皮膚、傷后即刻、傷后1天、3天、7天、14天及21天的血流量值，數值以圖像電壓值V表示。正常皮膚：可見分布較均勻的血流回聲（圖5a所示），該區(qū)域血流量平均值（1.75±0.29）V；傷后即刻：創(chuàng)面區(qū)域出現無血流區(qū)，創(chuàng)面周圍血流正?；蛏愿撸▓D5b所示），區(qū)域總體血流平均值（0.90±0.10）V，與燙傷前正常皮膚血流量值相比，P＜0.01；傷后1天：創(chuàng)面區(qū)無血流回聲，但創(chuàng)緣出現高血流區(qū)帶（圖1c所示），區(qū)域總體血流平均值（1.17±0.12）V，與燙傷后即刻血流量值相比，P＜0.01；傷后3天：創(chuàng)面仍無血流回聲，但無血流面積縮小，創(chuàng)緣強回聲區(qū)帶略減弱（圖5d所示），區(qū)域總體血流平均值（1.19±0.14）V，與燙傷后1天皮膚血流量值相比，P＞0.05，與燙傷前正常皮膚血流量值相比，P＜0.01； 傷后7天：創(chuàng)面無血流區(qū)域進一步縮小，區(qū)域總體血流量增加到（1.47±0.15）V（圖5e所示），與燙傷后3天皮膚血流量值相比，P＜0.01，與燙傷前正常皮膚血流量值相比，P＜0.01；傷后14天：創(chuàng)面無血流區(qū)域基本消失，創(chuàng)面周圍血流降低（圖5f所示），區(qū)域總體血流平均值（1.54±0.18）V，與燙傷后7天皮膚血流量值相比，P＞0.05，與燙傷前正常皮膚血流量值相比，P＜0.01；傷后21天：創(chuàng)面區(qū)域血流量接近正常（圖5g,h所示），區(qū)域總體血流平均值（1.70±0.18）V，與燙傷后14天血流量值相比，P＜0.01，與正常皮膚血流量值相比，P＞0.05，此時創(chuàng)面已完全愈合。結果見圖5a～g、表1。

3討論

燙傷皮膚創(chuàng)面愈合是一個受多因素影響的過程。血管作為人體內重要的運輸系統(tǒng)，為組織修復運輸營養(yǎng)物質、代謝產物和一些生物活性物質，是修復過程中一切修復程序得以正常進行的后勤保障，其在損傷修復過程中的作用是至關重要的[5-6]。傳統(tǒng)創(chuàng)傷修復理論將愈合過程分為炎癥、肉芽組織增生、再上皮化和改建塑形幾個階段，其中微小血管的變化貫穿于始終。大量研究表明，毛細血管形成的時間、多寡和質量直接影響到創(chuàng)傷愈合的程度，但具體的分子機制尚不清楚[7]。創(chuàng)面新生毛細血管在各種調節(jié)因素的精密調控下，形態(tài)結構不斷成熟，功能逐漸完善[8]。本實驗選用大鼠作為實驗動物，首先建立深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合模型，觀察燙傷創(chuàng)面毛細血管內皮細胞結構和功能的變化，檢測血流量改變與創(chuàng)面愈合間的規(guī)律，這將有助于進一步認識血管形成與創(chuàng)面所需營養(yǎng)物質轉運的關系。

燙傷對皮膚局部血管的直接傷害以及繼發(fā)的炎癥反應，造成該部位血管結構和功能的改變，導致創(chuàng)面及周圍皮膚組織的血流障礙，障礙程度與血管損傷程度密切相關。皮膚燙傷后，其創(chuàng)面由受熱中心部向外可為三個區(qū)帶，即中心凝固壞死區(qū)、組織變性區(qū)和組織反應區(qū)。其中凝固壞死區(qū)局限于熱源接觸部位，為不可逆損傷，深Ⅱ度燙傷時累及表皮層和大部分真皮層，真皮層內血管發(fā)生凝固性壞死，外觀蒼白；組織變性區(qū)位于凝固性壞死區(qū)外側，呈漸進性壞死狀。在無感染的情況下，為可逆性損傷，此區(qū)內有嚴重的充血和血栓形成；組織反應區(qū)位于最外側，此區(qū)皮膚血管不同程度擴張和充血，外觀紅色，壓之褪色。本實驗借助深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合模型，選取包括以上三個區(qū)帶在內的皮膚區(qū)域作為血流量檢測部位，動態(tài)觀察該區(qū)域血流量變化，可更客觀地反映燙傷后創(chuàng)面修復過程中創(chuàng)面血流變化規(guī)律。檢測發(fā)現：燙傷后即刻創(chuàng)面中心凝固壞死區(qū)無血流回聲；HE病理組織染色可見真皮內中、淺層血管發(fā)生凝固性壞死和真皮深層內血管血栓形成。傷后1天，創(chuàng)面血流圖中心凝固壞死區(qū)仍無血流回聲，但在組織變性區(qū)和組織反應區(qū)出現血流回聲增強區(qū)帶，考慮為炎性反應使該區(qū)域內血管擴張、充血所致，這種炎性充血在傷后3天血流圖仍可見到。傷后3天無血流區(qū)有所縮小，說明創(chuàng)面收縮及組織變性區(qū)部分血管功能開始恢復。所選檢測區(qū)域傷后即刻、傷后1天、傷后3天與傷前血流量相比均有極顯著性差異（P＜0.01），且傷后1天、傷后3天與傷后即刻相比也存在極顯著性差異，但傷后1天和傷后3天之間相比無統(tǒng)計學意義。傷后7天創(chuàng)面血流量進一步增加，無血流區(qū)域明顯縮小，與傷后3天相比有極顯著性差異，此時是創(chuàng)面愈合過程中肉芽組織形成高峰期，創(chuàng)緣肉芽組織內毛細血管大量增生。傷后14天無血流面消失，HE染色可見創(chuàng)區(qū)已被自創(chuàng)緣生長而來的肉芽組織所完全填充，總體血流量增加。傷后21天時，創(chuàng)面血流圖和傷前正常皮膚已接近，血流量經統(tǒng)計學分析較傷后14天有極顯著性增加，但與正常皮膚血流量無統(tǒng)計學差異。這種血流變化的規(guī)律與創(chuàng)面修復過程密切相關，其中的分子機制更加引起人們的重視。Ⅷ因子相關抗原被認為是血管內皮細胞最特異性的標志[9]，是觀察血管內皮細胞變化的一個可靠指標。本實驗采用Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色方法，對創(chuàng)面愈合過程中血管內皮細胞變化規(guī)律進行觀察，所得出的創(chuàng)面微血管形成特點與HE染色一致。

創(chuàng)傷愈合過程中，肉芽組織生成與退縮是傷口愈合和組織重建的關鍵步驟[10]。而肉芽組織中富含的毛細血管組織更是參與肉芽組織的生成與退縮。新生毛細血管的變化也從一個側面反映了創(chuàng)傷修復整個的生物學機制[11]。正常的創(chuàng)傷修復是一個嚴格、有序的調節(jié)過程。組織修復初期，各種細胞反應性的增殖、遷移和轉化，滿足組織修復的需要[12]。隨著傷口的閉合，完成各種作用的修復細胞迅速以凋亡的方式減少或消失，彼此間在時、空上的協調維持機體的完整性和穩(wěn)定性[13-14]。毛細血管形成的時間、多少以及消退的時機是創(chuàng)面愈合的結局中發(fā)揮作用重要的一部分[15-16]。

以上的研究結果可以清楚顯示，當機體遭受損傷后，即刻出現血流的改變，隨后大量的血管內皮細胞增殖，并逐漸相互連接成管腔，為血流灌注提供通路，攜帶更多的養(yǎng)料、氧氣等物質到達創(chuàng)區(qū)參與代謝，但此時的血流量與血管內皮細胞的再生并非同步增長，傷后14天血管內皮細胞的數量達到最高峰，但血流并沒有達最大值，說明有一些管腔可能為無效管腔，無供血和運輸功能，他們將隨著創(chuàng)面愈合的完成逐漸退變。因此，再上皮化完成后，血管內皮細胞數量減少，新生血管的消退、改建也逐漸完成，血流量逐漸恢復，接近正常水平。另外，組織內的膠原纖維也重排，參與完成愈合改建。有關內皮細胞增殖、遷移和凋亡的啟動機制對尚需作進一步的研究，借助信號轉導、基因敲除等研究手段，此方面的研究正不斷地深入。徹底闡明創(chuàng)面愈合的分子機制，特別是血管結構與功能的變化規(guī)律，將為以后采取創(chuàng)面愈合基因治療方法，在時空上調節(jié)愈合進程，改善修復質量產生深遠的影響。

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[收稿日期]2008-11-20[修回日期]2009-02-04

編輯/張惠娟