孫海平　汪曉峰

摘要選用對(duì)吸脹冷害敏感的大豆品種[Glycine max（L.）Merr.]中黃22為試材，PEG引發(fā)處理不同時(shí)間，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后提取種子子葉中的線粒體，不連續(xù)蔗糖梯度離心純化后，測(cè)定線粒體中抗氧化酶和抗氧化劑的變化情況。結(jié)果表明：PEG引發(fā)處理后大豆種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均提高，種子線粒體中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase APX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase MDHAR）和脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase DHAR）的活性均提高，還原型抗壞血酸（ascorbate ASC）/脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate DHA）和還原型谷胱甘肽（glutathione GSH）/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione GSSG）值增加。說明PEG引發(fā)處理增強(qiáng)了種子活力，提高了大豆種子抗吸脹冷害的能力。

關(guān)鍵詞大豆種子；PEG；線粒體；抗氧化還原系統(tǒng)

中圖分類號(hào)Q945.6+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2009）06-0135-02

許多栽培植物的種子在吸水萌動(dòng)的初始階段，如遇上低溫易發(fā)生吸脹冷害，影響種子的出苗率和成活率，使幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)下降，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降[1，2]。最早由Heydecker等提出通過種子引發(fā)來克服農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上遇到的種子冷害問題，且已證實(shí)具有顯著作用。陶宗婭等認(rèn)為發(fā)生吸脹冷害的要害是阻礙線粒體的正常發(fā)育，使其失去正常提供能量的功能[2，3]。同時(shí)Ana Jimenez等證實(shí)了線粒體中ASC-GSH的存在，以及ASC-GSH在非生物脅迫下的抗氧化脅迫作用[5，6]，說明該系統(tǒng)在抗性方面具有重要作用。因此，本文通過PEG引發(fā)處理后種子線粒體中抗氧化系統(tǒng)的變化與種子抗吸脹冷害能力的關(guān)系，以探討其可能的耐寒機(jī)理，并為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以大豆[Glycine max（L.）Merr．]品種中黃22種子為試材，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所提供。

1.2材料的處理

1.2.1發(fā)芽試驗(yàn)。將種子置于33%（W／V）PEG 6 000水溶液中，于25℃ 滲控不同時(shí)間（0h、12h、24h、48h、72h）后，同時(shí)置于4℃冰水中低溫吸脹24h，隨即進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)（25℃），檢測(cè)PEG滲控對(duì)大豆種子抗吸脹冷害能力的影響。

1.2.2線粒體的提取。將種子進(jìn)行同樣的處理，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后提取種子子葉中的線粒體，對(duì)線粒體中ASC-GSH抗氧化還原系統(tǒng)的成分進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3種子發(fā)芽率及活力測(cè)定

發(fā)芽試驗(yàn)按《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》（1996）進(jìn)行，發(fā)芽床為12 cm培養(yǎng)皿加雙層濾紙，用水濕潤(rùn)，每皿放25粒種子，3次重復(fù)。在HPG-280H人工氣候箱內(nèi)發(fā)芽，溫度為25℃ ，光強(qiáng)為80μmoL/m²，記錄發(fā)芽率及胚根干重。統(tǒng)計(jì)7d時(shí)的發(fā)芽率，發(fā)芽指數(shù)（GI）與活力指數(shù)（VI）按下式計(jì)算：GI=ΣGt／Dt；VI=GI×Sx。其中Gt為7d內(nèi)種子每天的發(fā)芽個(gè)數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)，Sx為發(fā)芽7d時(shí)25粒種子胚根的總平均干物重。

1.4線粒體的提取及純化

1.4.1提取[7]。大豆種子置于33%（W／V）PEG 6 000水溶液中，于25℃滲控不同時(shí)間（0h、12h、24h、48h、72h），并同時(shí)置于4℃冰水中低溫吸脹24h，放于HPG-280H人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，取20g大豆種子子葉，將子葉放在盛有約35mL研磨介質(zhì)中研磨成糊狀。研磨介質(zhì)的成分為：0.4mol/L蔗糖、50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH值8.0）、1mmol/L EDTA-Na2、0.1% BSA、1% PVP。勻漿用4層紗布過濾，濾液于1 000g離心10min，取其上清液10 000g離心15min，沉淀用20mL研磨介質(zhì)洗滌，在10 000g下再次離心15min，將沉淀懸浮于1mL懸浮介質(zhì)中即得到粗制線粒體懸浮液。懸浮介質(zhì)的成分為：0.4mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值7.2）、1mmol/L EDTA-Na2、0.6% BSA。所有操作均在4℃下進(jìn)行。

1.4.2純化[7]。配制蔗糖梯度溶液，按由高到低的順序?qū)?0%、52%、36%、20%的蔗糖溶液，依次鋪入12mL透明管中室溫放置1h后，將2mL粗制線粒體懸浮液平均鋪于斜面上，100 000g 4℃水平離心50min（Beckman SW55），收集分層于36%~52%界面處的線粒體于試管中并置于冰上，小心滴加4倍體積的勻漿緩沖液（未加巰基乙醇和BSA）混勻后16 000g 4℃離心10min，沉淀即為純化的線粒體。加入懸浮緩沖液后并放于液氮中速凍，于-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5線粒體檢測(cè)

1.5.1光學(xué)顯微鏡觀察。線粒體懸浮液與Janus GreenB應(yīng)用液按1∶1比例混勻，室溫染色15～20min，吸取適量線粒體懸液于載玻片上并加蓋玻片后放于顯微鏡下進(jìn)行觀察。線粒體呈藍(lán)綠色，橢圓形或卵圓形。

1.5.2完整性測(cè)定[9]?；瘜W(xué)試劑5% Triton X-100能破碎完整線粒體，測(cè)定其在加入前后琥珀酸-細(xì)胞色素C還原酶活性，以加入前后酶活性之比來確定線粒體的完整度。反應(yīng)介質(zhì)中含有0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl和10 mmol/L磷酸緩沖液、5mmol/L MgCl2，5μmol/L細(xì)胞色素C和20mmol/L疊氮鈉，在2.8mL反應(yīng)介質(zhì)中加入線粒體制備液0.1mL和200mmol/L琥珀酸鈉溶液0.1mL后，測(cè)定550nm波長(zhǎng)處光吸收值的變化。

1.6線粒體中抗氧化還原系統(tǒng)的測(cè)定

1.6.1抗氧化酶的提取和測(cè)定。參考Mittova等（2004）的方法測(cè)定APX、GR、MDHAR、DHAR和SOD的活性。

1.6.2抗氧化劑的提取和測(cè)定。在純化后的線粒體中加入預(yù)冷的5%磺基水楊酸劇烈振蕩，20 000g 4℃離心20 min，將上清液分裝并放于液氮中速凍后，于-80℃保存或直接進(jìn)行抗氧化劑分析。參考Jiang（2001）的方法測(cè)定ASA、DHA及ASA/DHA，參考Nagalakshmi（2001）的方法測(cè)定GSH、GSSG及GSH/GSSG。

2結(jié)果與分析

2.1PEG處理對(duì)大豆種子抗吸脹冷害能力的影響。從圖1可知，PEG滲控12h后種子發(fā)芽指數(shù)明顯上升，種子活力指數(shù)在滲控處理12h后上升較快，隨著滲控時(shí)間的延長(zhǎng)，還呈逐漸上升趨勢(shì)。表明引發(fā)處理可增強(qiáng)大豆種子抵抗吸脹冷害的能力。

2.2線粒體檢測(cè)

2.2.1光學(xué)顯微鏡下觀察。經(jīng)Janus GreenB染色后，在光學(xué)顯微鏡中可見藍(lán)綠色卵圓形和橢圓形顆粒，證明是線粒體。

2.2.2完整性分析。從表1可知，經(jīng)過PEG引發(fā)處理不同時(shí)間后，線粒體具有很好的完整度。其中引發(fā)處理12h后完整度達(dá)92.7%，是完整度最高的；而處理24h后線粒體的完整度為89.7%，也接近90%。

2.3PEG處理對(duì)種子線粒體中各抗氧化酶活性的影響

2.3.1PEG處理對(duì)種子線粒體中抗壞血酸過氧化物酶（APX）的影響。與對(duì)照相比，引發(fā)處理后大豆種子線粒體中APX活性逐漸增加（圖2），引發(fā)處理12h時(shí)APX活性比對(duì)照增加了5.28%；隨著引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，APX活性增加變緩，但引發(fā)處理72h時(shí)APX活性比48h時(shí)增加了0.45%，表明引發(fā)處理增強(qiáng)了APX活性。APX活性的增強(qiáng)可以使種子具有更好的清除活性氧的能力，有效地防御了氧脅迫的發(fā)生，從而提高了種子活力。

2.3.2PEG處理對(duì)種子線粒體中谷胱甘肽還原酶（GR）活性的影響。與對(duì)照相比，引發(fā)處理12h時(shí)，GR活性增加了57.9%（圖2）；引發(fā)處理24h與處理48h的GR活性變化不是很明顯，48h時(shí)GR活性比24h時(shí)只增加了0.75%。但隨著引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，GR活性在72h變化顯著，比對(duì)照增加了109.8%。

2.3.3PEG處理對(duì)種子線粒體中脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性和單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性的影響。隨著引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，DHAR和MDHAR的活性逐漸增強(qiáng)（圖2）；引發(fā)處理12h時(shí)DHAR的活性增加了40.83%，而MDHAR的活性增加了6.71%；當(dāng)引發(fā)處理72h時(shí)，DHAR的活性比12h時(shí)增加了35.66%，MDHAR的活性比12h時(shí)增加了51.18%。

2.3.4PEG處理對(duì)種子線粒體中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。經(jīng)PEG引發(fā)處理后SOD的活性均明顯高于對(duì)照（圖2），處理72h時(shí)SOD的活性比對(duì)照增加了58.94%，比引發(fā)12h時(shí)增加了23.33%。SOD作為植物線粒體對(duì)氧化脅迫防御策略的第二道防線，一旦活性氧（ROS）生成，O2在SOD催化下轉(zhuǎn)變成O2和H2O2。SOD活性的增強(qiáng)使活性氧（ROS）得到了有效清除，減少了氧脅迫的傷害，提高了種子抗吸脹冷害的能力。

2.4PEG處理對(duì)大豆種子線粒體中抗氧化物的影響

隨著引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，單個(gè)抗氧化物分子含量變化不明顯（表2），但是還原型和氧化型的比隨著引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)在逐漸增大。小分子抗氧化物的存在，對(duì)處于不良環(huán)境的種子起到了很好的保護(hù)作用。

3結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，PEG引發(fā)處理可以提高種子活力，增強(qiáng)種子中各種抗氧化酶的活性，從而增強(qiáng)種子抵抗吸脹冷害的能力，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中遇到的種子吸脹冷害問題，提供了可供解決的途徑。

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