王利紅　尹西翔　徐清忠　李賽鈺

摘要綜述了水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻中的應(yīng)用以及外源基因在水稻中的遺傳和鑒定，以期將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用到環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，生產(chǎn)出安全無污染的稻米。

關(guān)鍵詞水稻；轉(zhuǎn)基因技術(shù)；性狀改良

中圖分類號 Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739（2009）06-0131-02

世界上有超過30%的人口以稻米為主食，隨著世界人口的增加，對稻米的需求逐漸增加。據(jù)統(tǒng)計，未來25年糧食產(chǎn)量必須增加60% 才可滿足人口增長的需要[1]。世界尤其是我國將面臨糧食問題的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，迫切需要采取措施增加水稻等農(nóng)作物的產(chǎn)量。

隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物遺傳育種和品種改良上得到了廣泛應(yīng)用。自20世紀(jì)人類首次獲得可育的轉(zhuǎn)基因水稻以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻品種改良上得到了廣泛應(yīng)用[2]。該文綜述了近年來水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展、應(yīng)用進(jìn)程。

1水稻基因轉(zhuǎn)化方法

基因轉(zhuǎn)化的方法可分為2類：一是由載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，主要的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；另一類是直接的基因轉(zhuǎn)化，包括基因槍法、電擊法、PEG法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法[3,4]。近年來，應(yīng)用較多的為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法。

1.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是將外源基因插入農(nóng)桿菌的質(zhì)粒上，由載體將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞基因組中去。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在水稻上的遺傳轉(zhuǎn)化研究最早始于1986年，Baba等用PEG促進(jìn)農(nóng)桿菌原生質(zhì)球與水稻原生質(zhì)體融合的方法獲得了水稻愈傷組織，但未獲得轉(zhuǎn)基因植株[5]。隨后，Raineri等（1990）用粳稻的成熟胚與農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因愈傷組織，Southern分析表明，T-DNA已整合入基因組中，但未再生出轉(zhuǎn)基因植株[6]。Chan等首次報道用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻根系外植體（1992）和未成熟幼胚（1993）得到可育轉(zhuǎn)基因水稻，Southern blot分析表明，T-DNA上的基因可傳遞給后代[7，8]。Hiei等（1994）利用“超級-二元載體”首次實現(xiàn)對粳稻的高頻轉(zhuǎn)化，得到大量轉(zhuǎn)基因植株，使農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻獲得了突破[3]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化方法簡單、轉(zhuǎn)化效率高；再生植株可育率高；可轉(zhuǎn)入較大片段外源DNA；轉(zhuǎn)入基因的拷貝數(shù)少，大大降低了同源抑制產(chǎn)生的基因沉默機率[9，10]。

1.2基因槍法

基因槍轉(zhuǎn)化法是利用火藥、高壓氣體或高壓放電為動力，將包被有外源基因的顆粒通過基因槍高速轟擊組織或細(xì)胞，使外源基因整合到細(xì)胞基因組內(nèi)?；驑屴D(zhuǎn)化的最大優(yōu)點是轉(zhuǎn)化材料廣泛，細(xì)胞、組織和器官均可用作轉(zhuǎn)化而不受原生質(zhì)體培養(yǎng)的限制，從而減小了對基因型的依賴性，這是它適用于水稻轉(zhuǎn)化的主要原因[4]。目前，水稻轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)化材料有幼胚、胚性愈傷組織以及胚性懸浮細(xì)胞[9]。當(dāng)前，基因槍法已成為水稻遺傳轉(zhuǎn)化的可靠途徑。但基因槍法具有價格昂貴、轉(zhuǎn)化頻率偏低、導(dǎo)入的外源基因拷貝數(shù)高、在后代中容易丟失、對片段大的基因難以導(dǎo)入且嵌合體不易排除等缺點，需要進(jìn)一步改進(jìn)[10]。

1.3其他水稻基因轉(zhuǎn)化方法

PEG轉(zhuǎn)化法是禾谷類作物轉(zhuǎn)化中最早應(yīng)用的方法之一[11]。主要原理是利用化合物聚乙二醇（PEG）及高pH值條件誘導(dǎo)原生質(zhì)體體外攝取外源DNA。原生質(zhì)體作為受體具有群體數(shù)大、便于操作、DNA分子易于進(jìn)入獲得純合轉(zhuǎn)化子等優(yōu)點，但原生質(zhì)體培養(yǎng)難度大、再生頻率低、周期長、不適合水稻轉(zhuǎn)化研究。

電激法也是以原生質(zhì)體為受體的轉(zhuǎn)化方法[12]。其原理是利用短暫的電場脈沖作用，使原生質(zhì)體膜形成可逆的瞬間通道，使DNA進(jìn)入細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化效率高于PEG法，但目前很少應(yīng)用。

花粉管通道法是利用植物授粉后一段時間內(nèi)，從珠孔到珠心之間有一條花粉管通道，外源基因可通過此管道進(jìn)入胚囊并轉(zhuǎn)化尚不具備正常壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞，進(jìn)而借助于天然的種胚系統(tǒng)形成轉(zhuǎn)基因種胚。該方法機理尚不完全清楚，目前應(yīng)用并不是很多[4]。

2轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻上的應(yīng)用

2.1抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻

抗除草劑基因工程是生物技術(shù)的一個重要領(lǐng)域，目前，抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物種植面積占轉(zhuǎn)基因作物種植面積的比重較大[13]。Bar基因是抗除草劑基因之一，Christou等（1991）和Datta等（1992）將Bar基因轉(zhuǎn)入水稻后，水稻可以抵抗大劑量的草丁磷[14，15]。轉(zhuǎn)抗除草劑基因的成功不僅解決了直播稻的化學(xué)除草問題，而且解決了雜交稻制種純度的關(guān)鍵問題。

2.2抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻

目前，應(yīng)用于水稻抗蟲性狀改良的外源基因主要有蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因（Bt基因）、昆蟲蛋白酶抑制劑（PI基因）和植物凝集素基因3種，其中Bt基因如cryIA（b）、cryIA（c）是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的殺蟲基因[10]。Fujimoto等（1993）首次使用電激法將cry基因轉(zhuǎn)入粳稻中，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因R2代幼苗抗蟲性明顯提高[16]。戴正元等（2007）以攜帶cryIA（b）基因的“克螟稻”為抗蟲供體親本，將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到優(yōu)良恢復(fù)系R6547、R818中，配制雜交稻組合表現(xiàn)良好的雜種優(yōu)勢水平[17]。

2.3抗病轉(zhuǎn)基因水稻

水稻抗病基因工程包括抗病毒、抗細(xì)菌和抗真菌基因工程?，F(xiàn)在許多重要的抗病基因如CP（抗水稻條紋病毒）、Xa21（抗枯萎?。ib（抗稻瘟?。?、Cecropin B（抗菌肽基因）等基因已從植物或其他生物中分離克隆，并在水稻抗病轉(zhuǎn)基因中作了大量研究，取得了顯著成績[4，10]。Wang等（1999）將Pib基因?qū)肴毡厩纾玫搅丝沟疚敛∞D(zhuǎn)基因水稻，將天蠶抗菌肽B基因Cecropin B導(dǎo)入粳稻秀水11和中花11中，轉(zhuǎn)基因水稻植株對水稻白葉枯病和細(xì)條病的抗性都出現(xiàn)了不同程度的提高[18]。

2.4抗逆轉(zhuǎn)基因水稻

現(xiàn)已證實，不利的天氣和土壤等環(huán)境條件是影響稻谷產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的重要因素。Xu等（1996）將大麥后期胚胎富蛋白基因HVA1導(dǎo)入水稻，提高了水稻抗旱和抗鹽的能力[19]。Yokoi等（1998）將擬南芥中的磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶基因（Gpat）轉(zhuǎn)入水稻內(nèi)，提高了水稻不飽和脂肪酸的含量和抗寒能力[20]。另外，一些和超氧自由基清除有關(guān)的基因被轉(zhuǎn)入水稻，提高了水稻的抗逆能力。隨著抗逆基因的大量克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)展，越來越多的抗逆基因被轉(zhuǎn)入水稻中[9]。

2.5轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻品質(zhì)改良上的應(yīng)用

目前，很多研究者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對水稻的營養(yǎng)、食味品質(zhì)進(jìn)行了改良。美國Louisiana州立大學(xué)的研究人員Zheng等（1995）將菜豆種子蛋白質(zhì)基因?qū)胨局斜磉_(dá)，使得轉(zhuǎn)基因水稻種子總蛋白質(zhì)含量增加4%，賴氨酸含量也有所提高[21]。高越峰等（2001）將從四棱豆中獲得的高賴氨酸蛋白基因?qū)刖局谢?號，并獲得轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行賴氨酸含量測定，結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)化對照相比，有2棵植株賴氨酸含量分別增加6.0%和12.4%[22]。Goto等（1999）育成了1種籽粒富含鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻，這種轉(zhuǎn)基因水稻的籽粒含有大豆鐵蛋白基因的編碼序列，這種水稻籽粒的含鐵量相當(dāng)于一般籽粒的3倍，食用這種“鐵蛋白稻米”可為成年人提供每日13～15 mg需鐵量的30%～50%[23]。李梅等（2008）在不同環(huán)境下研究了鐵蛋白轉(zhuǎn)基因水稻礦質(zhì)積累情況，發(fā)現(xiàn)其具有更強的積累鐵的能力[24]。

3外源基因在水稻中的表達(dá)與鑒定

3.1水稻中外源基因的表達(dá)

外源基因整合入目的植物的基因組后，其表達(dá)與穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)基因的失活與沉默有關(guān)。外源基因整合進(jìn)目的植物基因組后，易被植物基因組存在的修飾與限制系統(tǒng)所識別并加以修飾和抑制，使之失活和沉默。研究表明，DNA甲基化能引起染色體結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。另外，共抑制與轉(zhuǎn)基因失活有關(guān)。共抑制現(xiàn)象主要是由于外源基因重復(fù)，外源基因和內(nèi)源基因編碼區(qū)具有同源性或外源基因在強啟動作用下，產(chǎn)生過量的同源轉(zhuǎn)錄本引起的[25]。

3.2水稻中外源基因的鑒定

利用轉(zhuǎn)基因方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株及其產(chǎn)生的后代，主要分以下幾個層次鑒定：一是外源基因整合的鑒定，主要有Southern雜交和PCR法檢測陽性。二是外源基因轉(zhuǎn)錄水平的鑒定，有Northern雜交和RT-PCR檢測法。三是外源基因表達(dá)蛋白的檢測，主要有3種：生化反應(yīng)檢測法、免疫學(xué)檢測法、生物學(xué)活性的檢測。四是報告基因的酶法檢測，常用的報告基因有：gus、nos、ocs等[4，9]。最后轉(zhuǎn)基因植株必須移栽于大田，進(jìn)行田間鑒定，對改良性狀和其他農(nóng)藝性狀進(jìn)行評價。

4轉(zhuǎn)基因水稻的環(huán)境安全問題

轉(zhuǎn)入的基因本身是不會對水稻生長及環(huán)境帶來危害，但轉(zhuǎn)基因操作的過程可能導(dǎo)致受體基因組的變異；植物遺傳轉(zhuǎn)化中的篩選標(biāo)記基因?qū)θ梭w無益，必須在轉(zhuǎn)基因植物中有效去除；基因漂流可能使抗性基因轉(zhuǎn)移到雜草中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雜草?？蒲泄ぷ髡哒饾u關(guān)注轉(zhuǎn)基因標(biāo)記基因的有效去除以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的超級雜草問題[9，26]，盡管人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因食物會對人體產(chǎn)生傷害，但轉(zhuǎn)基因大米、大豆、棉花等已經(jīng)產(chǎn)生，而且表現(xiàn)出了抗蟲、抗病以及高產(chǎn)等優(yōu)勢。因此，人們必須用客觀公正的眼光去看待它們。

5展望

當(dāng)前調(diào)控重金屬在植物體內(nèi)代謝過程的關(guān)鍵基因逐漸被克隆，人們可以將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用到水稻重金屬污染調(diào)控過程中。利用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式改變重金屬在水稻中的含量及形態(tài)，降低其食用產(chǎn)生的人體健康風(fēng)險。隨著轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)導(dǎo)后標(biāo)記基因的去除和安全性鑒定及人體健康風(fēng)險評價工作的逐漸深入，轉(zhuǎn)基因水稻的食用、環(huán)境安全性將得到解決?？梢源_信，轉(zhuǎn)基因水稻將會以其獨特的優(yōu)勢，使水稻品種不斷得到優(yōu)化和改良，將更快地適應(yīng)社會的需求。

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