（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川，成都，610075）

【摘要】 目的：觀察蒿芩清膽加減方含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用，并初步探索其作用機制。方法：蒿芩清膽加減方含藥血清，體外培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞，通過不同濃度血清作用于細(xì)胞進(jìn)行干預(yù).觀察給藥后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。用MTT抑瘤實驗，琥珀酸脫氫酶（SDH），乳酸脫氫酶（LDH）的測定，細(xì)胞周期的測定，觀察細(xì)胞分化的情況。結(jié)果：光鏡下血清組培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞數(shù)量呈減少趨勢，以高劑量組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量改變趨勢明顯。MTT比色法顯示含藥血清濃度越高，抑制作用越強.SDH活性顯示蒿芩清膽加減方血清組系使Lewis肺癌細(xì)胞內(nèi)的SDH活性明顯上升，并以高劑量組作用最為明顯。LDH活性顯示蒿芩清膽加減方血清高劑量組降低細(xì)胞內(nèi)LDH活性最明顯。結(jié)論：蒿芩清膽加減方含藥血清作用于Lewis肺癌細(xì)胞株后，細(xì)胞具有向正常細(xì)胞生理狀態(tài)分化成熟的趨勢。

【關(guān)鍵詞】蒿芩清膽加減方；Lewis肺癌細(xì)胞；分化誘導(dǎo)；含藥血清

【中圖分類號】 R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A【文章編號】 1005-1074(2009)04-0002-02

蒿芩清膽湯出自《重訂通俗傷寒論》，由青蒿腦、淡竹茹、仙半夏、赤茯苓、青子芩、生枳殼、陳廣皮和碧玉散組成。目前對該方抗腫瘤研究不多，黃秀深教授經(jīng)過長期臨床用藥發(fā)現(xiàn)，該方在與人參，苦參等益氣扶正，清熱解毒的中藥加減化裁后，對肺癌，肝癌等各種惡性癌癥有較好的治療效果。為了解其作用機制，本次實驗以誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞分化進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細(xì)胞株 Lewis肺癌細(xì)胞株由成都中醫(yī)藥大學(xué)病理實驗室提供。

1.1.2 實驗動物與藥品 健康SD大鼠，體重200～220g，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：川實動管97(質(zhì)8)號。蒿芩清膽加減方各中藥均購于北京同仁堂成都分店。按常規(guī)煎煮法制成每1ml蒿芩清膽加減方含1g生藥濃度藥液；RPMI1640培養(yǎng)基，GIBCO公司；硝基四唑氮藍(lán)（MTT），Sigma公司；琥珀酸脫氫酶（SDH）測試盒，乳酸脫氫酶（LDH）測試盒，考馬斯亮蘭測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 給藥 將SD大鼠隨機分為蒿芩清膽加減方大中小劑量3個組和生理鹽水對照組，每組12只.依據(jù)文獻(xiàn)^[1]，蒿芩清膽加減方按臨床成人（60kg）每天服用生藥10倍給SD大鼠灌胃，即每天給藥劑量＝人每天治療劑量×動物等效劑量系數(shù)×10倍。每只每次給藥2ml（每1ml水煎液含1g生藥），每日2次，連續(xù)3d，生理鹽水對照組給以同劑量的生理鹽水。

1.1.4 血清的制備 末次灌胃前禁食12h.末次灌胃后1h，股動脈采血，靜置2h，3000r/min離心15min，分離血清，經(jīng)56℃，30min滅活處理后，用0.45um微孔濾膜過濾除菌，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 血清分組 實驗共分為5組.將蒿芩清膽加減方含藥血清分為小（5％）、中（10％）、大（15％）3組；生理鹽水血清組及空白對照組。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)光鏡觀察 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以0.5×10⁵個細(xì)胞/孔接種于6孔板，分組加藥，培養(yǎng)6d，常規(guī)Wright－Giemsa染色；油鏡下計200個細(xì)胞，觀察其分化成熟度。

1.2.2 MTT抑瘤實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞按2×10³/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每組復(fù)設(shè)6個平行孔，每孔體積200ul，培養(yǎng)24h后給藥組依次加入?。?％）、中（10％）、大（15％）含藥血清，生理鹽水組加等量生理鹽水血清，空白對照組加等體積無血清RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，加MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸取培養(yǎng)液，以200ulDMSO溶解結(jié)晶，振蕩10min后上酶標(biāo)儀于波長490nm處測每孔的光吸收值（A），并求出生長抑制率。

1.2.3 乳酸脫氫酶（LDH）的測定 取在對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，分組加藥，培養(yǎng)6d后收集細(xì)胞，勻漿機破碎，在波長440nm處測每孔的吸光度，按試劑盒說明操作，按公式計算細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶活力。

1.2.4 琥珀酸脫氫酶（SDH）的測定 方法同上，在波長600nm處測每孔的吸光度，按試劑盒說明操作，按公式計算細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶活力。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化 以1×10⁵個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，藥物處理細(xì)胞方法同上，細(xì)胞培養(yǎng)6d后，收集細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)>10⁶個)，用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗均重復(fù)3次.結(jié)果采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理，組間計量資料采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，顯著性為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 光鏡形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡觀察下，空白對照組及生理鹽水血清組：Lewis肺癌細(xì)胞貼壁生長良好，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。蒿芩清膽加減方血清組培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞數(shù)量呈減少趨勢，其中以高劑量組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量改變趨勢明顯，處理組部分細(xì)胞脫落，貼壁細(xì)胞漿內(nèi)顆粒多，細(xì)胞界限不清，呈單層細(xì)胞，不重疊，染色后，細(xì)胞著色較一致，細(xì)胞呈多邊形，大小較一致，核仁減少，胞質(zhì)增加，核質(zhì)比例明顯下降，油鏡下200個細(xì)胞算多核仁數(shù)為：含藥血清高劑量組為9.1％，中劑量組14.8％，低劑量組26.2％，生理鹽水血清組為37.0％，空白組40.1％。

2.2 MTT抑瘤率觀察 蒿芩清膽加減方對Lewis肺癌細(xì)胞有抑制作用，含藥血清濃度越高，抑制作用越強，以高劑量組作用最強，中劑量組次之，具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3 蒿芩清膽加減方對Lewis肺癌細(xì)胞SDH活性的影響 見表2。

2.4 蒿芩清膽加減方對Lewis肺癌細(xì)胞LDH活性的影響 見表3。

2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 見表4。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，是指在分化誘導(dǎo)劑的作用下，惡性腫瘤細(xì)胞的形態(tài)，生化等方面的諸多標(biāo)志向正常細(xì)胞的方向演化，甚至于完全轉(zhuǎn)化為正常細(xì)胞.作為分化誘導(dǎo)劑，中藥具有毒副作用較小的優(yōu)點.但當(dāng)前對中藥分化誘導(dǎo)研究較少，且多為單味中藥研究.中藥復(fù)方在預(yù)防腫瘤發(fā)生、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)以及抑制腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等方面的研究已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，但目前對中藥復(fù)方誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的研究并不多。對于蒿芩清膽湯抗腫瘤研究，特別是對其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用還沒有開展實質(zhì)性的研究，導(dǎo)師黃秀深教授根據(jù)長期臨床工作發(fā)現(xiàn)本方在加減化裁后對肺癌，肝癌等均有較好療效，因此本實驗選擇蒿芩清膽加減方分化誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞作為研究。

形態(tài)學(xué)上的分化成熟是表明惡性腫瘤細(xì)胞分化的標(biāo)志，腫瘤細(xì)胞的形態(tài)與其相應(yīng)正常細(xì)胞存在較大差別，誘導(dǎo)分化后的腫瘤細(xì)胞喪失其惡性形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征，向同組織來源的正常細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，因此考察與鑒定誘導(dǎo)分化處理前后腫瘤細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征的變化，歷來都是評價外源性物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞是否分化的一個重要判斷依據(jù)。本次試驗顯示，給藥后蒿芩清膽加減方組細(xì)胞排列疏松，且較對照組收縮變圓；呈單層細(xì)胞，不重疊；染色后，細(xì)胞著色較一致，細(xì)胞呈多邊形，大小較一致；胞質(zhì)增加，核質(zhì)比例明顯下降。由此可知蒿芩清膽加減方含藥血清有誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化的作用。

乳酸脫氫酶（LDH）和琥珀酸脫氫酶（SDH）均是細(xì)胞內(nèi)代謝標(biāo)志酶，前者與細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)，后者則與細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)^[2]。蒿芩清膽加減方含藥血清使Lewis肺癌細(xì)胞的SDH的活性明顯增強，LDH活性明顯減弱，說明蒿芩清膽加減方能有效使Lewis肺癌細(xì)胞異常的無氧酵解得到抑制，恢復(fù)有氧代謝，從而向正常細(xì)胞分化。

許多誘導(dǎo)分化實驗中出現(xiàn)了細(xì)胞周期停滯的現(xiàn)象，表明細(xì)胞周期阻抑是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的一個重要特征^[3]。大量研究已經(jīng)證實腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期動力學(xué)特點主要是細(xì)胞群主體部分分布于DNA合成的活躍的S期，而分化細(xì)胞群主體分布于DNA合成靜止的G₀/G₁期。蒿芩清膽加減方含藥血清作用于Lewis肺癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期呈現(xiàn)阻滯于G₀/G₁期，S期細(xì)胞數(shù)減少，這與多數(shù)腫瘤分化誘導(dǎo)劑作用后細(xì)胞周期的改變一致^[4]。推測蒿芩清膽加減方是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，達(dá)到分化誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的作用。但蒿芩清膽加減方含藥血清是通過什么機制來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期？是否是通過抑制CDK或（并）Cyclin的活性，引起Rb蛋白的去磷酸化；或（并）增強了CKI的活性，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞阻斷在G₀/G₁期、減少S期細(xì)胞還需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 李振光，王凈凈.關(guān)于中藥血清藥理學(xué)方法的思考[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2002，（9）2：5

[2] 陳嘯梅.組織化學(xué)工冊[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1982:224.

[3] 孔令華，劉玉琴，等.惡性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[J].癌癥進(jìn)展雜志，2004.11；02(06).

[4] 宋 莉.人參環(huán)氧炔醇對人肝癌細(xì)胞株HepG2、LEWIS肺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用[J].癌癥，2004，23(8)

(收稿日期：2008.12.10)