（解放軍九四醫(yī)院檢驗科，江西，南昌，330000）

【摘要】隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，微生物的分子水平上的研究也取得了快速發(fā)展，與其他方法相比，其靈敏度高、可重復(fù)好和可靠性好，是目前應(yīng)用最廣泛的方法之一。

【關(guān)鍵詞】分子生物學(xué)；技術(shù)；腸道微生物

【中圖分類號】R446.5【文獻標識碼】A【文章編號】1005-1074(2009)04-0032-01

人體腸道中寄生著種類繁多和數(shù)量巨大的微生物，構(gòu)成了腸道微生態(tài)體系。這正常情況下，這些微生物對機體無害，或有利于機體的健康，為正常菌群。正常菌群參與宿主對營養(yǎng)素的消化、吸收與合成；刺激其免疫機制。這種與宿主的腸道相互依存又相互影響的關(guān)系形成了動態(tài)的微生物平衡[1]。微生物學(xué)研究表明，環(huán)境條件的輕微變化，均可導(dǎo)致機體微生態(tài)系統(tǒng)的變化，造成菌群的失調(diào)，對宿主的腸道功能產(chǎn)生不良影響[2]。腸道微生態(tài)的破壞，還可引起內(nèi)外源性感染，干擾機體營養(yǎng)代謝和免疫功能，甚至嚴重影響機體健康，導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，微生物的分子水平上的研究也取得了快速發(fā)展，與其他方法相比，其靈敏度高、可重復(fù)好和可靠性好，是目前應(yīng)用最廣泛的方法之一。

1腸道微生物總DNA的提取

腸道微生物總DNA的提取是研究胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，只有獲得盡可能完整的DNA模板才能為后續(xù)分析提供可信性。目前獲得腸道菌群總DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法，以及近年來一些大型公司推出的商業(yè)試劑盒。酚/氯仿抽提法間接從樣品中獲取基因組DNA是實驗室常用提取細菌DNA的方法，金晶等[3]通過對酚/氯仿法提取腸道微生物總DNA進行優(yōu)化，得到了基本完整的基因組DNA.這一經(jīng)典的技術(shù)由于其操作過程不需要特殊的儀器設(shè)備，得到的DNA純度相對較高，被廣泛的應(yīng)用。

2腸道微生物基因片段獲取

Sharles等于1990年在E.Coli基因組中發(fā)現(xiàn)的一種基因間重復(fù)保守序列，大小約為126bp。1991年，Hulton等在Salmonella typhimurium，Yersinia pseudo- tuberculosis，Klebsiella pneumoniae和Vibrio cholerae中也發(fā)現(xiàn)這種高度保守的重復(fù)序列，由于該序列主要存在與腸桿菌科，故稱之為腸桿菌基因間的重復(fù)共有序列（Enterobacterial repetitive intergenic，ERIC）。Versalovic等認為ERIC-PCR擴增的是兩個相鄰的ERIC保守序列之間的區(qū)域，由于不同的細菌基因組上的ERIC重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同，從而得到由一系列大小不同片段組成的DNA指紋圖譜不同地域和不同年代的同一株菌其指紋圖譜一樣，不同的方法提取基因組DNA，圖譜具有良好的可重復(fù)性。潘莉等[4]為了了解以糞檢有無白細胞區(qū)分的兩類腹瀉兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)的特征及其與健康兒童的差別，應(yīng)用ERIC-PCR對其腸道微生物總DNA進行擴增，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)了一段與腹瀉相關(guān)的未知基因序列。在檢測運動員不同訓(xùn)練強度下腸道菌群結(jié)果變化ERIC-PCR也能取得很好的結(jié)果[5]。

3DNA遺傳指紋圖譜技術(shù)分析

3.1變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳變性梯度凝膠電泳(Denaturing GradientGel Electrophoresis，DGGE)是由Fisher和Lerman發(fā)明用于檢測DNA突變的技術(shù)，其原理是利用長度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度的不同，通過梯度變性膠將DNA片段分離開來。DGGE可以用來檢測除最高溫度解鏈區(qū)域以外的所有發(fā)生單個堿基變化的DNA片段。另一個基于相似原理的技術(shù)，稱為溫度梯度凝膠電泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE)，與DGGE的不同之處在于不是變性劑呈現(xiàn)線性梯度，而是溫度呈現(xiàn)線性梯度，使得不同的核酸序列停留在凝膠的不同位置從而得以分離。該技術(shù)很突出的優(yōu)點：可以分離具有細微差異的基因組片段；從凝膠中切下譜帶，然后測序分析來揭示群落成員系統(tǒng)發(fā)育的從屬關(guān)系，檢測出特異細菌種群的存在；具有同時檢測多個樣品，可以對不同樣品進行比較。

3.2限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技術(shù)于1980年由人類遺傳學(xué)家Bostein提出。該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA 分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生不同長度大小、不同數(shù)量的限制性酶切片段，于是電泳圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性。末端限制性片段長度多態(tài)性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisn，T-RFLP)與RFLP相似，只是在 PCR 引物末端標記熒光，擴增的基因片段被限制性內(nèi)切酶消化后，那些帶有熒光標記的末端限制性片段就可在DNA測序儀上檢測出來。Cecilia等[6]利用T-RFLP技術(shù)分析抗生素治療和服用益生菌產(chǎn)品對人類腸道微生物區(qū)系的影響，結(jié)果表明T-RFLP技術(shù)易于監(jiān)控部分優(yōu)勢菌群，但是利用培養(yǎng)技術(shù)卻很實現(xiàn)對它們的監(jiān)控。

3.3分子雜交技術(shù)-熒光原位雜交熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization， FISH)是在 20 世紀80 年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù)，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法?；驹硎牵喝绻粰z測的細菌基因組DNA纖維切片上的靶 DNA與所用的核酸探針是同源互補的，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。該法具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點。人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡對生理、健康有著重要作用，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使研究人體腸道微生物各種群的數(shù)量、結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化更為直接和精確。當然，分子生物學(xué)技術(shù)人目前尚有一些缺陷，在與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法方法結(jié)合使用，將能夠在人體胃腸道復(fù)雜的微生物生態(tài)研究中發(fā)揮重要的作用。

參考文獻

[1]楊汝德，李武明，許燕濱．動物和人類的腸道菌群的形成及意義[J]．微生物學(xué)雜志，1998，18（1）：52-55．

[2]顧國勝，任建安，黎介壽．結(jié)腸粘膜表面保護系統(tǒng)與腸道菌群[J]．中國使用外科雜志，2003，23（2）:118-120．

[3]金晶，彭穎，李曉波．快速提取腸道微生物基因組DNA的方法[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2007，7（1）：100-103．

[4]潘莉，杜惠敏，黃海冬，等．腹瀉兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)特征的ERIC-PCR指紋圖分析[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2003，15（13）：141-143．

[5]喬德才，陳敬，魏桂芳，等．用DNA指紋圖譜技術(shù)分析運動負荷對運動員腸道菌群區(qū)系結(jié)構(gòu)的影響[J]．體育科學(xué)，2004，24（1）：73-75．

[6]Cecilia Jernberg， Asa Sullivan，et al. Monitoring of antibiotic-induced alterations in the human intestinal microflara and detection of probiotic strains by use of terminal restriction fragment length polymorphism[J].Appl Environ Microbiol，2005，71(1):501-506.

(收稿日期：2009.01.20)