[摘要] 目的 探討轉(zhuǎn)染bcl-2基因治療大鼠局灶性腦缺血的作用機(jī)制是否與bFGF蛋白的表達(dá)增加有關(guān)。方法 采用線栓法制作大鼠MCAO模型，取150只Wistar大鼠，隨機(jī)分成三組，分別為腦室內(nèi)注射生理鹽水組（生理鹽水組）、腦室內(nèi)注射空質(zhì)粒組（空質(zhì)粒組）和腦室內(nèi)注射質(zhì)粒pLXSN介導(dǎo)的bcl-2基因組（Bcl-2組）。每組50只。分別在缺血再灌注后3、6、24、48、72h觀察bFGF蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 大鼠MCAO后bFGF蛋白在生理鹽水組與空質(zhì)粒組之間，缺血后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均無顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果顯示其表達(dá)高峰在缺血后24h，而bcl-2組早期即大量表達(dá)且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，并在同一時(shí)間段表達(dá)明顯強(qiáng)于其他組（P＜0.05）。結(jié)論 pLXSN-bcl-2基因腦保護(hù)機(jī)制可能是通過促進(jìn)bFGF的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] bFGF； bcl-2基因； 腦缺血； 基因治療

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2009）13-34-02

Study of the Effect of the Expression of bFGF in Tranfected bcl-2 Gene Therapy of Cerebral Ischemia in Rat

XIAO Lijun1 HE Zhiyi2

1.The Third People’s Hospital of Liaoyang，Liaoning 111000；2.The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001

[Abstract] ObjectiveTo study the protective effct of bcl-2 against neuroal injury and the possible roles of alteration in the expression of bFGF following cerebral ischemia in rat. Methods150 wistar rats were randomly assingned in 3 groups（bcl-2 treated group，saline group and pLXSN group），there were 50 rats in each group. And we studied the bFGF expression in 3，6，24，48，72hours after MCAO temporary ischemia of the MCAO for 2 hours was induced. ResultsTheexpression of bFGF in the saline group and pLXSN group weren’t different in each time（P＞0.05）， bFGF expressed early in the bcl-2 group and lasted for a long time，while its expression was more than other groups at the same time. ConclusionBcl-2 can effectivly attenuate ischemic brain injury and increase the expression of bFGF in the ischemic brain，indicating that the neuroprotective of estrogen is associated with up-regulation of bFGF in cerebral ischemia.

[Key Words]bFGF； bcl-2 gene； Cerebral ischemia； Gene treatment

近年來，腦血管病已成為目前人類疾病的三大死亡原因之一，而腦梗死是腦血管病中最常見的疾病之一，故對(duì)腦梗死的研究一直是神經(jīng)科的重要課題。目前認(rèn)為，缺血性腦血管病實(shí)際上是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜病理過程。缺血后神經(jīng)元的死亡有兩種形式，即凋亡和壞死，凋亡發(fā)生在許多細(xì)胞中，這一過程是細(xì)胞的主動(dòng)性死亡，凋亡性細(xì)胞死亡是一個(gè)基因控制的過程，有RNA和蛋白質(zhì)的合成[1]。在調(diào)節(jié)凋亡的基因中，bcl-2（B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因）是首先被發(fā)現(xiàn)有抑制凋亡作用的基因。目前許多學(xué)者將這種具有抗凋亡作用的基因用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究[2-5]，也得出相同的結(jié)論，近年來，堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）與bcl-2之間的關(guān)系日益受到人們的重視[5]，這也有利于進(jìn)一步研究bcl-2抗凋亡的作用機(jī)制?，F(xiàn)將我們的研究成果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

體重280～300g的Wistar大鼠150只（由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供），隨機(jī)分為腦室內(nèi)注射生理鹽水組（生理鹽水組）、腦室內(nèi)注射空質(zhì)粒組（空質(zhì)粒組）和腦室內(nèi)注射質(zhì)粒pLXSN介導(dǎo)的bcl-2基因組（bcl-2組）三組，每組又隨機(jī)分為缺血再灌注3、6、24、48、72h組。每小組動(dòng)物10只。

1.2 大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型的制作

采用改良的Longa栓線法。全部大鼠統(tǒng)一采用栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈并于梗死后2h再灌注。

1.3 質(zhì)粒pLXSN介導(dǎo)Bcl-2基因的制備方法

參照何志義等[6]在《質(zhì)粒pLXSN介導(dǎo)人bcl-2 cDNA抑制局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡》中描述的制備方法。

1.4 分組實(shí)驗(yàn)

各組動(dòng)物均于缺血再灌注后存活3、6、24、48、72h處死。

1.5 bFGF免疫組化分析

免疫組化分析采用SABC法。試劑來自武漢博士得公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，應(yīng)用SPSS11.5軟件處理，采用t檢驗(yàn)，P < 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

bFGF蛋白的表達(dá)：在生理鹽水組與空質(zhì)粒組之間，缺血后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均無顯著性差異（P＞0.05），其表達(dá)高峰在缺血后24h，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。與空質(zhì)粒組比較，bcl-2組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均顯著增加，表達(dá)高峰在缺血后3h，并持續(xù)至72h。見表1，圖1，2。

3 討論

Bcl-2是1984年Tsugimoto等[8]從濾泡性淋巴細(xì)胞瘤中分離出來的一種癌基因。Bcl-2作為抑制細(xì)胞凋亡的抗凋亡因子，已被許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。bFGF（Basic fibroblast growth factor）是FGF基因家族中主要成員之一，是一種具有多種生物學(xué)活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。在腦組織中分布廣泛，它能誘導(dǎo)軸突向外生長(zhǎng)，具有提高神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，使更多的神經(jīng)元在病理狀態(tài)下得以生存。增生的膠質(zhì)細(xì)胞及損傷修復(fù)的神經(jīng)元能產(chǎn)生更多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)顱腦損傷后的修復(fù)過程[9，10]。在正常情況下，腦內(nèi)僅有少量bFGF表達(dá)。

目前，轉(zhuǎn)bcl-2基因治療缺血性腦梗死在實(shí)驗(yàn)室研究階段取得了一定進(jìn)展，但其作用機(jī)制卻不甚明確，有學(xué)者認(rèn)為與抑制Ca2+釋放有關(guān)，也有學(xué)者認(rèn)為bcl-2通過阻止促凋亡信號(hào)傳遞，或阻止這些誘導(dǎo)基因產(chǎn)物而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，還有人認(rèn)為bcl-2可通過抑制自由基而發(fā)揮抗凋亡作用。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到，在生理鹽水組與空質(zhì)粒組，其bFGF蛋白在MCAO后3h即有表達(dá)，在24h 表達(dá)最強(qiáng)。而在實(shí)驗(yàn)組，bFGF蛋白在缺血后3h即開始顯著表達(dá)，持續(xù)至72h，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均比對(duì)照組明顯。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化的表達(dá)結(jié)果顯示，bcl-2組bFGF蛋白的表達(dá)在不同時(shí)間明顯強(qiáng)于二對(duì)照組，而且在3h明顯增強(qiáng)，持續(xù)高表達(dá)至72h。這表明，bcl-2的腦保護(hù)機(jī)制與bFGF的表達(dá)上調(diào)有密切關(guān)系，可能通過bFGF的釋放起到保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，改善缺血區(qū)血供以及促進(jìn)新生血管形成等作用，從而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，bcl-2通過促進(jìn)bFGF的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元、營(yíng)養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞、促進(jìn)新生血管形成等，從而實(shí)現(xiàn)其腦保護(hù)作用，可能是其抗凋亡作用機(jī)制之一，這為臨床治療缺血性腦梗死開辟了一條新的途徑，使基因治療成為可能，但如何更好地、真正地應(yīng)用于臨床還需進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2009-03-03）