方文成　崔紅俠　張傳平

[摘要]目的 檢測乳腺癌骨髓中CK-19mRNA的表達,探討其在乳腺癌微轉移中的臨床意義。方法 采用RT-PCR方法檢測95例乳腺癌患者和15例乳腺良性疾病骨髓中CK-19mRNA的表達。結果 95例乳腺癌中,51例(53.7%)骨髓中檢測出CK-19mRNA的表達。CK-19mRNA陽性表達率與乳腺癌臨床分期和腫瘤大小有關(P<0.05),而于月經(jīng)、腋淋巴結轉移狀況、ER、PR蛋白的表達均無顯著性相關(P>0.05)。CK-19陽性病人的局部復發(fā)率、遠處轉移率與CK-19陰性病人比較,差異有顯著意義(P<0.05)。結論 CK-19mRNA可作為乳腺癌骨髓微轉移指標之一,骨髓微轉移的檢測能夠更好地指導臨床分期和評估預后。

[關鍵詞]乳腺癌;骨髓;微轉移;CK-19

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號]1004-8650(2009)10-014-02

乳腺癌是一種全身性惡性疾病,影響其預后的主要因素是全身轉移。骨髓內血管為獨特的竇狀結構,有濃縮或使癌細胞停留的作用,因此骨髓是乳腺癌最容易發(fā)生遠處轉移的部位。研究發(fā)現(xiàn),約30%腋淋巴結陰性的乳腺癌患者術后5年內出現(xiàn)復發(fā)、遠處轉移而導致死亡,其主要原因是淋巴結、骨髓及血液中微轉移灶的存在[1]。我們通過應用RT-mRNA技術,以細胞角蛋白19(Cytokeratin-19, CK-19)為標志,檢測乳腺癌患者骨髓中的微轉移狀況,探討其在乳腺癌微轉移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2002年6月-2007年10月在我科住院的乳腺癌患者95例,均為女性,平均年齡27-65歲,中位年齡48.5歲。其中Ⅰ期12例,Ⅱ期47例,Ⅲ期36例。腋窩淋巴結轉移陽性59例,陰性36例,絕經(jīng)前52例,絕經(jīng)后43例。所有患者均經(jīng)手術治療,術后病理類型:浸潤性導管癌 61例,浸潤性小葉癌23例,髓樣癌 7例,黏液腺癌4例。術前所有患者均未行放療、化療等治療,并經(jīng)胸部X線、B超、CT和骨掃描等檢查未發(fā)現(xiàn)明顯轉移灶。同期15例乳腺良性疾病作對照。

1.2 標本采集

乳腺癌患者術中經(jīng)皮下抽取胸骨骨髓6-8ml,乳腺良性疾病經(jīng)皮膚抽取骨髓6-8ml,肝素抗凝后,用生理鹽水稀釋,然后淋巴細胞分離液離心,收集淋巴細胞層,PBS洗滌,加入Trizol試劑1ml,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR擴增:使用美國ABI公司AB15700型PCR擴增儀,美國BIO-RAD公司PowerPac Basic型凝膠成像系統(tǒng)。骨髓中 RNA提取、cDNA合成、PCR試劑均由上海生工生物有限公司提供,實驗方法參考試劑說明書。CK-19的上游引物為5'-AGGTGGATTCCGCTCGGGGCA-3',下游引物為5-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3',擴增產(chǎn)物片段長度為460bp。內參照β-actin上游引物為5'-ATCTGGGACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3',下游引物為5'-CGACATACTCGTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3',擴增產(chǎn)物片段長度為838bp。RT-PCR熱循環(huán)反應的條件為95℃ ,預變性5 min,95℃ 接鏈45s,55℃ 退火30s,72℃ 延伸55s,32個循環(huán),72℃ 末次延伸5min。

1.3.2 結果判定:取PCR產(chǎn)物6μl行2%瓊脂糖(含溴化已錠0.5μg/ml)凝膠電泳,在DNA Maker 指示下,以β-actin(838bp)做為陽性對照,在凝膠電泳中可出現(xiàn)460bp的條帶即為CK-19表達陽性,為骨髓微轉移陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS10.0軟件包對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 CK-19mRNA在骨髓中的表達情況(見圖1)

95例乳腺癌患者骨髓中CK-19mRNA的表達陽性者51例,占53.7%,15例乳腺良性疾病骨髓中無一例表達CK-19mRNA,差異有顯著性意義(P<0.05)。

M:DNA條帶(100-1000bp);1.陰性對照;2.陽性對照;3. CK-19mRNA表達陽性;4. CK-19mRNA表達陽性陰性

2.2 骨髓中CK-19mRNA的表達與傳統(tǒng)預后指標的關系(見表1)。

CK-19mRNA陽性表達率與乳腺癌臨床分期和腫瘤大小有關(P<0.05),而與月經(jīng)、腋淋巴結轉移狀況、ER、PR蛋白的表達均無顯著性相關(P>0.05)。

2.3 骨髓CK-19mRNA的表達與術后局部復發(fā)和轉移的關系

截至2007年9月,全組患者隨訪37-61個月,中位隨訪時間49個月。95例乳腺癌中13例出現(xiàn)局部復發(fā)和轉移,其中CK-19mRNA表達陽性組11例,占21.6%(11/51),CK-19mRNA表達陰性組2例,占4.55%(2/44),兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

乳腺癌目前已被廣泛認為是一種全身性惡性疾病,即在早期即可發(fā)生血行播散,影響乳腺癌預后的主要原因是遠處的轉移。特別是淋巴結、骨髓及血液中微轉移灶的存在。因此,早期發(fā)現(xiàn)淋巴結微轉移有著重要的意義。乳腺癌微轉移是指常規(guī)病理學檢查檢測不到的存在于患者淋巴結、血液及骨髓等體內的微小轉移灶。它常以單個細胞或微小細胞團的形式存在,并在一定的條件下分裂增殖成轉移灶。

檢測骨髓微轉移的常用方法是RT-PCR技術,能夠快速擴增腫瘤細胞內特異性mRNA的表達,可從10⁶-10⁷個細胞中檢測出一個腫瘤細胞,并預示腫瘤的微小轉移,具有病理組織學和免疫細胞化學技術所不可比擬的敏感性[2]。角蛋白19(Cytokeratin,CK-19)是一種針對上皮細胞的單抗,是上皮性細胞的標志基因,僅在正常乳腺細胞和乳腺癌細胞中表達,而不在淋巴細胞、骨骼和外周血中表達。本組95例乳腺癌患者的骨髓中有51例表達CK-19 mRNA,其陽性率53.7%。而乳腺良性疾病患者中無一例表達,兩組具有統(tǒng)計學意義(P<0.01) 。表明它可作為乳腺癌骨髓微轉移的指標有一定的特異性。

本組結果顯示,乳腺癌骨髓中CK-19陽性表達率隨臨床分期及腫塊的大小的增加而增高。乳腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期骨髓中CK-19mRNA的表達陽性率分別為33.3%、44.7%和72.2%,差異有顯著性,提示腫瘤分期越高轉移的可能性越大。而且腫塊>2cm者CK-19陽性表達率較≤2cm者也明顯增高,值得注意的是,在腫塊≤2cm及Ⅰ期乳腺癌患者中不同程度的骨髓微轉移,說明乳腺癌是一個全身性疾病,早期即可發(fā)生遠處轉移。但是腋淋巴結轉移陽性組與陰性組之間CK-19陽性表達率無明顯差別(P≤0.05),表明乳腺癌血行轉移與腋淋巴結轉移為兩條不同的轉移途徑,腫瘤細胞早期即可進入血液發(fā)生全身轉移。

近年來報道顯示,微轉移的臨床意義尚有爭議,但至少可揭示其具有轉移傾向,并可判斷患者的預后[3]。 Stathopoulou等[4]認為乳腺癌微轉移檢出與無瘤生存率和總生存率相關,是判斷預后的主要指標。本研究顯示,CK-19mRNA表達陽性與CK-19mRNA表達陰性比較,兩組術后局部復發(fā)和轉移發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明微轉移的檢測也是判斷預后的主要指標之一。Braun[5]等檢測552例乳腺癌骨髓微轉移患者,發(fā)現(xiàn)CK-19mRNA表達陽性和局部復發(fā)、遠處轉移有明顯相關性,輔助化療可有效降低患者復發(fā)的危險,是判斷預后的獨立指標。因此,對檢出有微轉移的患者,在其發(fā)展成臨床轉移之前,給予積極輔助治療,可以降低患者的復發(fā)率和轉移率。

參考文獻:

[1] Cqrcorofo P,Bergossi L,Basaqlia E,et al.Prognostic and therapeutic impact of sentinel node micrometastasis in patients with invasive breast cancer[J].Tumori,2002,88(3):S4-5.

[2] Von Kenbel Doeberitz M,Lacroix J. Nucleic acid based techniques for the detection of rare cancer cells in clinical samples[J].Cancer Metastasis Rev, 1999,18(1):43-64.

[3] Xenidis N,Vlachonikolis l,Mavroudis D,et al.Peripheral blood circulating cytokeratin-19 mRNA-positive cells after the completion of adjuvant chemotherapy in patients with operable breast cancer[J].Ann Onco, 2003 ,14(6):849-855.

[4] Stathopoulou A,Vlachonikolis I,Mavroudis D,et al.Molecular detection of cytokeratin-19-positive cells in the peripheral blood of patients with operable breast cancer: evaluation of their prognostic significance.J Clin Oncol,2002,20(16):3404-3412.

[5] Braun S,Pantel K, Muller P, et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer[J]. N Engl J Med,2000,342(8):525-533.

(收稿日期2009-06-30)