陳　江　李建蓉　陳任生　何星星

[摘要]目的 探討MDM2在結(jié)腸黏膜癌變過程中的表達和意義。方法 應(yīng)用免疫組化方法檢測MDM2在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸腺癌中的表達。結(jié)果 DM2在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺癌中的陽性表達率逐步升高,分別為10%(2/20)、81.8%(18/22)、98.5%(65/66),組間比較差異均有顯著性 (P<0.05)。MDM2的表達強度和結(jié)腸腺癌的分化程度無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 DM2參與結(jié)腸黏膜向癌組織演變的過程,并在早期發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]MDM2;結(jié)腸腺瘤;結(jié)腸腺癌

[中圖分類號]R735.3+5 [文獻標識碼] A [文章編號]1004-8650(2009)10-04-03

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤,近年來其發(fā)病率有增加趨勢。結(jié)腸腺瘤是癌前病變,和結(jié)腸癌發(fā)生密切相關(guān)。目前認為,正常結(jié)腸黏膜-結(jié)腸腺瘤-結(jié)腸癌這一演變過程,是由癌基因和抑癌基因的異常表達積累導(dǎo)致的。MDM2是近來發(fā)現(xiàn)的癌基因,和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),本研究用免疫組化的方法檢測MDM2在結(jié)腸黏膜癌變過程中的表達,旨在探討結(jié)腸癌的發(fā)病機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本:來源于2007年1月-2008年9月期間南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)及結(jié)腸鏡活檢的組織,經(jīng)100ml/ L 福爾馬林固定,石蠟包埋,4μm 厚連續(xù)切片,并經(jīng)HE染色病理診斷證實。總共108例標本,正常結(jié)腸黏膜20例,腺瘤22例,腺癌66例。

1.1.2 實驗試劑:兔抗人突變型p53單克隆抗體、鼠抗人MDM2單克隆抗體、鼠抗人增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、DAB顯色試劑盒和PV-9000試劑盒均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 主要儀器:DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海);Leica RM-2135型石蠟切片機(德國);Nikon 55i 電子數(shù)碼顯微鏡(日本)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測MDM2的步驟:免疫組化染色按PV-9000試劑盒(購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司) 操作說明書進行。所有蠟塊制成厚4μm 的切片,切片脫蠟至水,充分洗滌后,置枸櫞酸修復(fù)液中,微波修復(fù)15 min。MDM2工作液濃度為1∶100,Ⅰ抗孵育時4 ℃過夜,Ⅱ、Ⅲ抗孵育時37 ℃溫箱內(nèi)各20min,DAB 顯色。試驗設(shè)已知陽性、陰性對照及PBS代替一抗為空白對照,作為質(zhì)量控制標準。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定:MDM2陽性染色主要定位于細胞核,部分出現(xiàn)在胞漿中。結(jié)果判斷標準參照Fromowitz陽性細胞半定量分級法。隨機觀察5個高倍視野(×400)計數(shù)細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù),得出陽性細胞百分率。先根據(jù)陽性細胞所占的百分數(shù)計分:≤5%者為0分,6%-25%者為1分,26%-50%者為2分,>50%者為3分;再根據(jù)陽性細胞染色強度計分:無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;然后根據(jù)兩者相乘所得的總分進行結(jié)果判定:0分為陰性“-”,1-2分為弱陽性“+”,3-4分為中度陽性“++”,6-9分為強陽性“+++”。

1.2.3 統(tǒng)計方法:采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析,計量資料采用方差分析,組間率的比較采用χ2檢驗,MDM2表達強度比較采用秩和檢驗,結(jié)腸腺癌中MDM2的表達強度和腺癌分級的相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析。顯著性檢驗水準選α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MDM2在各組織中的表達

總共108例標本,正常結(jié)腸黏膜20例,腺瘤22例,腺癌66例,三組間的年齡、性別無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。MDM2的陽性表達(見表1)分別為:正常結(jié)腸黏膜組2例(10%),腺瘤組18例(81.8%),腺癌組65例(98.5%),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 結(jié)腸腺癌的分化程度和MDM2表達強度的關(guān)系

66例腺癌中,能明確分級的有41例,其中高分化腺癌級10例,中分化腺癌21例,低分化腺癌10例,行腺癌分級和MDM2表達強度+,++,+++的等級相關(guān)分析,結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤,在我國發(fā)病率呈上升趨勢[1],結(jié)腸癌被認為大多起源于腺瘤。正常結(jié)腸黏膜在各種損傷因素的影響下,使抑制細胞增殖的抑癌基因失活,或使刺激細胞增殖的原癌基因激活,導(dǎo)致細胞增殖過度和失去分化,引起結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有學(xué)者提出了大腸腺瘤—腺癌序列的分子發(fā)病模式[2,3]。MDM2 (murine double munite2 ,MDM2) 為小鼠雙微體基因,是近年發(fā)現(xiàn)的一種癌基因,MDM2蛋白對野生型p53具有負性調(diào)節(jié)功能,介導(dǎo)p53降解和抑制p53轉(zhuǎn)錄活性;而MDM2的表達水平又受野生型p53的調(diào)節(jié),當(dāng)野生型p53水平增高時,便可激活MDM2基因轉(zhuǎn)錄并表達;如此,野生型p53和MDM2之間形成了一個負反饋調(diào)節(jié)環(huán),在維持野生型p53的正常生理功能方面具有重要作用[4]。MDM2除抑制抑癌基因p53產(chǎn)生,其本身也有致癌作用。有關(guān)MDM2在結(jié)腸腺瘤中的陽性表達結(jié)果,各家報道不一致[5,6]。我們的研究顯示,在正常結(jié)腸黏膜中,MDM2的表達基本為陰性,而在腺瘤中的陽性表達率為81.8%,有顯著性差異,說明在結(jié)腸癌前病變中,MDM2即發(fā)揮作用。MDM2在結(jié)腸腺癌中的表達率高達98.5%,其表達強度和陽性表達率均顯著高于腺瘤和正常結(jié)腸黏膜。我們進一步分析了結(jié)腸腺癌分級和MDM2表達強度的關(guān)系,結(jié)果表明,在結(jié)腸腺癌的低分化、中分化和高分化分級中,其MDM2的表達強度無顯著性差異。這和其他研究結(jié)果相一致[7,8]。這說明MDM2參與了結(jié)腸黏膜癌變的過程,在結(jié)腸癌的始發(fā)和早期形成發(fā)展中起重要作用,而在結(jié)腸癌的分化中無明顯作用。

本研究由于標本資料等限制,未探討MDM2的表達同結(jié)腸癌的分期和轉(zhuǎn)移的關(guān)系,還有待于進一步研究。

參考文獻:

[1] 項永兵,高立峰,徐望紅等.惡性腫瘤發(fā)病率的時間趨勢分析方法.中華流行病學(xué)雜志,2004:86-90.

[2] de Leon M P,Di GC.Pathology of colorectal cancer.Dig Liver Dis, 2001,33:372-88.

[3] Fearon ER.Molecular genetic studies of the adenoma-carcinoma sequence. Adv Intern Med,1994,39:123-47.

[4] Alarcon-Vargas D,Ronai Z.p53-MDM2-the affair that never ends. Carcinogenesis,2002,23:541-547.

[5] 郭潔,沈志祥,譚詩云.MDM2與P14ARF在結(jié)腸腫瘤中的表達及意義.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2002:144-146.

[6] 熊首先,朱尤慶,何軍.MDM2和p53在大腸癌組織中的表達及其意義.長江大學(xué)學(xué)報(自科版)醫(yī)學(xué)卷,2007:11-13,111.

[7] 閆再宏,張蓉,梁慧霞等.大腸癌中MDM2和p53基因表達及生物學(xué)意義.中國全科醫(yī)學(xué),2006:1067-1068.

[8] 郭潔,沈志祥,譚詩云.凋亡調(diào)控通路(p53-MDM2-p14)ARF對結(jié)腸癌生物學(xué)行為的影響.山東醫(yī)藥,2003:12-14.

(收稿日期2009-06-29)