郭云翮

摘要 目的:采用大鼠切口疼痛模型,研究鞘內(nèi)應(yīng)用鹽酸奈福泮的鎮(zhèn)痛作用。方法:(1)觀察切口疼痛大鼠的痛行為學(xué),用累積疼痛評(píng)分法測(cè)定疼痛程度。(2)運(yùn)用免疫組化技術(shù)觀察奈福泮對(duì)脊髓背角c-fos基因表達(dá)的影響。結(jié)果:(1)手術(shù)組大鼠累積疼痛評(píng)分明顯高于F組,術(shù)后IT奈福泮可明顯降低術(shù)后疼痛引起的累積疼痛評(píng)分。 (2) 與S組相比,奈福泮ED50量82.6μg鞘內(nèi)注射時(shí)明顯抑制FLI-N的產(chǎn)生,作用主要產(chǎn)生在Ⅰ-Ⅱ?qū)印ⅱ?Ⅵ層。結(jié)論:(1)IT奈福泮對(duì)切口疼痛大鼠有鎮(zhèn)痛作用。(2)IT注射奈福泮的抗傷害作用與抑制脊髓背角c-fos蛋白的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 奈福泮;鞘內(nèi)注射;切口疼痛模型;C-Fos基因

[中圖分類號(hào)] R181.8+1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1004-8650(2009)12-155-02

鹽酸奈福泮(NFP)是一種新型非麻醉鎮(zhèn)痛藥,其作用與阿片受體無(wú)關(guān)。本研究的目的在于采用大鼠切口疼痛模型,觀察鞘內(nèi)注射奈福泮對(duì)術(shù)后大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及脊髓后角c-fos基因表達(dá)的影響以探討其抗傷害作用的機(jī)制。

1材料和方法

藥品和試劑鹽酸奈福泮注射液(NefopamHydrochlorideInjection,湖北同濟(jì)奔達(dá)鄂北制藥有限公司);羊抗兔c-fos多克隆抗體、PV-6001試劑盒、DAB顯色劑 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);異氟醚(isoflurane,Rhone—Poulenc);麻醉機(jī)(Dragen)

鞘內(nèi)置管 體重250~300g的雄性SD大鼠,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,以5%的水合氯醛0.6ml/100kg腹腔注射麻醉后,按揚(yáng)建平法[1]在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔植入PE10聚乙烯導(dǎo)管(實(shí)驗(yàn)藥物均經(jīng)所埋導(dǎo)管注入蛛網(wǎng)膜下腔),妥善固定,術(shù)畢給予20g/l利多卡因注射液20μl,凡是10s內(nèi)兩后肢不能負(fù)重、拖地以及針刺小腿無(wú)回縮等逃避反應(yīng),16～20min以后又恢復(fù)負(fù)重者為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,飼養(yǎng)5天后用于實(shí)驗(yàn)。

切口疼痛模型的建立大鼠吸入1.4%異氟醚麻醉后,將其左后爪進(jìn)行消毒,按Brerman等[2] 法從足底近端0.5 cm處向趾部作一長(zhǎng)約1 cm的切口。切開(kāi)皮膚,用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割,保持肌肉的起止及附著完整,按壓止血,用細(xì)線縫合皮膚共兩針即成切口疼痛模型。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)采用累積疼痛評(píng)分法[2]評(píng)定疼痛強(qiáng)度,待大鼠手術(shù)清醒后觀察兩后爪著地及負(fù)重情況,后爪被壓迫發(fā)白表示負(fù)重,如后爪翹起不著地,記2分;如后爪著地但不負(fù)重,記1分;如后爪著地并且負(fù)重,記0分。從術(shù)后1h起每5分鐘觀察1次,每次1分鐘,以1分鐘內(nèi)最常采取的姿勢(shì)為標(biāo)準(zhǔn),共觀察1h,以術(shù)側(cè)足評(píng)分減去對(duì)側(cè)足評(píng)分即為所得累積疼痛評(píng)分。

動(dòng)物及分組 根據(jù)序貫實(shí)驗(yàn)計(jì)算出奈福泮的ED50量為82.6μg。取置管成功SD大鼠15只,隨機(jī)分為三大組,Nfp組、S組、F組。Nfp組鞘內(nèi)注射奈福泮ED50量82.6μg行切口術(shù),S組注鹽水無(wú)藥物,行切口術(shù)方法;F組不做手術(shù)只注鹽水

組織采集和樣本制備Fos表達(dá)的高峰時(shí)間為術(shù)后2h,因此切口疼痛模型建立2 h后采用5%水合氯醛( 0.6ml/kg)麻醉,開(kāi)胸,暴露心臟,經(jīng)左心室灌流固定。先用200 mL0.9%生理鹽水快速灌流沖洗血液,繼以4%多聚甲醛500 mL(0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH 7.4)持續(xù)灌注1 h左右,接著灌入300ml的20%蔗糖和0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液的混合液。剪開(kāi)椎板取腰膨大處脊髓在4%多聚甲醛中后固定2 h,而后放人20%的蔗糖PBS液中,置4℃冰箱過(guò)夜,冰凍冠狀連續(xù)切片,片厚20μm,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌(3次,5 min/次),3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧酶370C暖箱中孵育30min,加一抗(c_f0s抗體1:800),37℃ 濕盒孵育5h,4℃冰箱過(guò)夜滴加二抗(羊抗兔),37℃孵育1h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌(3次,5 min/次),DAB顯色30min,自來(lái)水充分沖洗,脫水、封固鏡檢,核內(nèi)棕色顆粒為陽(yáng)性產(chǎn)物,每組各有一張加PBS液替代c-fos一抗,作為免疫組化的陰性對(duì)照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。P﹤0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

1、鞘內(nèi)給予奈福泮對(duì)切口疼痛大鼠行為學(xué)的影響。F組大鼠活動(dòng)如常,雙后爪著地且負(fù)重;S組大鼠的術(shù)側(cè)足常翹起,偶爾著地,但極少負(fù)重;Nfp組術(shù)側(cè)足可著地,并且負(fù)重。與F組相比,手術(shù)組大鼠累積疼痛評(píng)分均明顯升高(P<0.01);與S組相比,Nfp組可明顯降低累積疼痛評(píng)分(P<0.01)。

2、鞘內(nèi)給予奈福泮對(duì)切口疼痛大鼠c-fos蛋白表達(dá)的影響。S組大鼠于左爪按Brennan法行手術(shù)后只注入NS,可使同側(cè)L4-L6脊髓灰質(zhì)c-fos蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),c-fos免疫陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)元(FLI-N)在各層均有分布,但主要分布在Ⅰ-Ⅱ?qū)印ⅱ?Ⅵ層,以Ⅰ-Ⅱ?qū)臃植甲疃?。而Nfp組可明顯抑制FLI-N的產(chǎn)生,它們的作用主要產(chǎn)生在Ⅰ-Ⅱ?qū)?、?Ⅵ層。

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用的外周傷害性刺激模型系大鼠切口疼痛模型,此模型是由Brennan等于1997年提出的,施行此手術(shù)的大鼠表現(xiàn)自發(fā)性疼痛行為,機(jī)械性異常疼痛,機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏,這些疼痛行為與臨床上外科手術(shù)和術(shù)后狀態(tài)一致[3,4]。

鹽酸奈福泮(NFP)是一種新型非麻醉鎮(zhèn)痛藥,其作用與阿片受體無(wú)關(guān),在臨床廣泛用于各種急慢性疼痛、內(nèi)臟平滑肌絞痛及術(shù)后鎮(zhèn)痛,對(duì)呼吸、循環(huán)系統(tǒng)無(wú)作用。目前對(duì)其鎮(zhèn)痛機(jī)制意見(jiàn)不一。Novelli等[5]研究發(fā)現(xiàn)了奈福泮在電壓敏感性鈣通道和鈣離子介導(dǎo)的途徑中是通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)cGMP的形成起作用,能夠抑制NMDA介導(dǎo)的興奮性中毒而有中樞鎮(zhèn)痛作用。本研究觀察到術(shù)后大鼠IT奈福泮累積疼痛評(píng)分明顯降低,顯示出IT應(yīng)用NFP有鎮(zhèn)痛作用;同時(shí)抑制脊髓背角Ⅰ-Ⅱ?qū)?、?Ⅵ層的c-fos免疫陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)元的表達(dá),表明NFP可能是通過(guò)抑制了與傷害性感受的傳導(dǎo)有關(guān)的脊髓背角Fos陽(yáng)性神經(jīng)元的活動(dòng),抑制了中樞敏感化,阻止了傷害性感受在脊髓內(nèi)的進(jìn)一步傳導(dǎo),從而產(chǎn)生抗傷害作用。

參考文獻(xiàn)

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Novelli A, Diaz-Trelles R, Groppetti A, Fernandez-Sanchez MT Nefopam inhibits calcium influx, cGMP formation, and NMDA receptor-dependent neurotoxicity following activation of voltage sensitive calcium channels[J]. Amino Acids. 2005 Mar;28(2):183-91. Epub 2005 Feb 18

(收稿日期2009-11-13)