彭修娟　張亞強　宋小妹

摘 要:目的:探討不同炮制方法對杜仲中綠原酸含量的影響。方法:采用HPLC法測定杜仲生品及6種不同炮制品中綠原酸的含量。結(jié)果:綠原酸的含量:鹽蒸制>鹽制砂炒2>鹽制砂炒1>鹽炒制2>鹽炒制1>清炒>生品。結(jié)論:炮制方法對杜仲中綠原酸的含量有影響,且以鹽蒸法較為理想。

關(guān)鍵詞:杜仲;炮制方法;綠原酸

中圖分類號:R283.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1673-2197(2009)06-0029-02

杜仲為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥樹皮,為名貴中藥材,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,具有補肝腎、強筋骨、安胎[1]之功效。杜仲皮含有多種活性成分[2],其中綠原酸(Chlorogenic Acid) 和松脂醇二葡萄糖苷(Pinores inoldiglucoside,PDG)有降壓作用 [3,4]。本文以綠原酸含量為指標(biāo),比較各炮制方法對其含量的影響,為臨床鹽制杜仲提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Sartorius BP211D型電子分析天平(德國),FW177型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司),Waters2690高效液相色譜儀,Waters996二極管陣列檢測器,Millennium32色譜工作站, H66025T型超聲清洗儀。

1.2 試藥

杜仲原藥材購自西安市藥材市場,經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院中藥教研室王繼濤教授鑒定為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥樹皮。綠原酸對照品(購于中國藥品生物制品檢定所,批號:0753-200111)。流動相所用甲醇為色譜純,水為重蒸水(實驗室自制),鹽水均為2%的食鹽水溶液,磷酸等其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同炮制品的制備

杜仲生品的制備:將杜仲除去粗皮,洗凈潤透,用切藥刀切成3～4mm的橫絲(垂直于膠絲的生長方向)。

不同炮制品的制備:

清炒法:取100g杜仲絲置炒制容器內(nèi),中火炒至顏色加深,有焦斑,絲易斷時,取出晾涼。

鹽炒制1:取100g杜仲絲,置容器內(nèi)加鹽水拌勻,加蓋悶潤。待鹽水被吸盡后,置炒制容器內(nèi),中火炒至顏色加深,有焦斑,絲易斷時,取出晾涼。

鹽炒制2:取100g杜仲絲,置炒制容器內(nèi),中火炒至顏色加深,有焦斑,絲易斷時,取出,噴淋鹽水拌勻,再置炒制容器內(nèi)炒干,取出晾涼。

鹽制砂炒1:將河砂置鍋內(nèi)炒至靈活狀態(tài)后,取用鹽水悶潤好的杜仲絲100g傾入鍋內(nèi),中火反復(fù)翻炒20min,取出晾涼。

鹽制砂炒2:將專用溫度計置入鍋內(nèi),放入適量細(xì)砂,將100g杜仲絲置入鍋內(nèi),中火反復(fù)翻炒20min后取出,篩去細(xì)砂,噴淋鹽水拌勻,再置炒制容器內(nèi)炒干,取出晾涼。

鹽蒸制:取100g杜仲絲,置容器內(nèi)加鹽水拌勻,加蓋悶潤。待鹽水被吸盡后,置鍋內(nèi)中火蒸制1h,取出晾涼。

2.2 色譜條件

色譜柱:Welch Materials C18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇-0.4%磷酸溶液(25∶75);柱溫:25℃;檢測波長:327nm;流速:1mL?min-1;進(jìn)樣量:10μL。

2.3 對照品溶液的制備

取綠原酸對照品,精密稱定,加甲醇溶解、定容,制成每1mL含綠原酸0.406mg的對照品溶液,備用。

2.4 供試品溶液的制備

取上述不同炮制品粉末各1g,精密稱定,置于三角瓶內(nèi),精密加入甲醇25mL,稱重,超聲1h,取出,用甲醇補足缺失量,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取綠原酸對照品溶液1mL,置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別精密吸取8、10、12、14、16、18、20μL,按2.2項下的色譜條件測定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為:Y=3174278.9899X+1505.6609(r=0.9996),結(jié)果顯示,綠原酸對照品在0.324～0.812μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液,按上述色譜條件,分別于0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣10μL,測定綠原酸的峰面積。結(jié)果表明,供試樣品在12h內(nèi)峰面積穩(wěn)定,RSD 為1.62%。

2.7 精密度試驗

取同一供試品溶液10μL,按上述色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣5次,測定綠原酸的峰面積。結(jié)果表明,精密度良好,RSD為 0.97%。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一樣品共5份,照“供試品溶液制備”項下的方法制備供試品溶液,按上述色譜條件,測定綠原酸的峰面積。結(jié)果表明,本方法重復(fù)性良好,RSD為0.59%。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品6份,精密加入一定量的綠原酸對照溶液,照“供試品溶液制備”項下的方法制備供試品溶液,按上述色譜條件,取10μL注入液相色譜儀,測定綠原酸的峰面積,計算回收率。結(jié)果表明,綠原酸的平均回收率為99.92%,RSD為1.68%。結(jié)果見表1。

2.10 樣品的含量測定

分別吸取各供試品溶液10μL,注入液相色譜儀,按2.2項下的色譜條件測定,記錄峰面積,由回歸方程計算綠原酸的含量,結(jié)果見表2,對照品及樣品HPLC色譜圖見圖1。

結(jié)果表明:不同炮制樣品中,綠原酸含量:鹽蒸制>鹽制砂炒2>鹽炒制2>鹽制砂炒1>鹽炒制1>清炒>生品。

3 討論

(1)流動相的選擇,通過對乙腈-不同濃度磷酸溶液系統(tǒng),及其乙腈-磷酸溶液不同比例的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行考察,最終選擇甲醇-0.4%磷酸溶液(25∶75)出峰較為理想,可達(dá)到基線分離。

(2)對于檢測波長的選擇,進(jìn)行了全波長掃描,綠原酸選用327nm,系統(tǒng)穩(wěn)定性好,干擾小。

(3)通過對不同炮制方法對杜仲中有效成分影響的實驗研究,結(jié)果表明,生品的綠原酸含量明顯低于各炮制品,這可能是由于生品杜仲中橡膠絲的作用使其有效成分難以溶出,這為傳統(tǒng)的“炒斷絲”炮制標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

(4)鹽制杜仲中綠原酸的含量普遍高于清炒法和生品,這為鹽制入腎的傳統(tǒng)用藥理論提供了科學(xué)依據(jù)。

(5)通過對不同鹽制杜仲方法的比較,結(jié)果表明,砂炒杜仲中綠原酸的含量高于不加砂的炮制方法,這可能是由于砂可以提高炒制溫度,傳熱也比較均勻,進(jìn)而提高了杜仲的斷絲率所致。

(6)鹽蒸制杜仲中綠原酸的含量最高,但是否優(yōu)于傳統(tǒng)的炒制法,還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1996:286.

[3] CHARLES J SIH, RAVIKUMAR P, HUANG FUCHIN,et al. Separation and Synthesis of pinoresinol diglucoside moides olive[J].J Am Chem Soc,1976(17):5412.

[4] 李家實.杜仲皮與葉化學(xué)成分初步研究[J].中藥通報,1986,11(8):41.

[5] 臧友維.杜仲化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中草藥,1989,20(4):42-43.

(責(zé)任編輯:曾楚華)

The Influence of Different Process Technics on the

Contents of Chlorogenic Acid in Eucommia Ulmoides Oliv

Abstract:Objective:To evaluate the influence of different process technics on the contents of Chlorogenic Acid in Eucommia ulmoides Oliv. Methods:The determination of Chlorogenic Acid in raw products and 6 kinds of different processed products of Eucommia ulmoides Oliv was performed by HPLC.Result and Conclusions:Different process technics had a remendous influence on the content of Chlorogenic Acid in Eucommia ulmoides Oliv.And the traditional process technic of Salt-steaming Method.

Key words:Eucommia Ulmoides Oliv;Process Technics;Chlorogenic Acid