楊劍超 袁 芳 王新慧 史瑤瑤 隋 娜 王寶山

摘 要:本試驗檢測了鹽芥(Thellungiella halophila)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性蛋白的含量,以及抗氧化系統(tǒng)中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)的活性。結(jié)果表明,高濃度NaCl(>100 mmol/L)處理后鹽芥的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著高于擬南芥。擬南芥抗氧化系統(tǒng)酶活性尤其是CAT活性,明顯受制于高濃度NaCl環(huán)境(>100 mmol/L),而鹽芥的抗氧化系統(tǒng)并沒有受到顯著的不良影響。

關(guān)鍵詞:鹽芥;擬南芥;NaCl脅迫;滲透調(diào)節(jié)物質(zhì);抗氧化酶系統(tǒng)

中圖分類號:Q949.748.3 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2009)12-0048-04

近年來,研究植物的耐鹽機制并篩選抗鹽基因用于培育抗鹽品種已成為解決因土壤鹽漬化造成的農(nóng)業(yè)方面減產(chǎn)問題的重要途徑之一。鹽芥(Thellungiella halophila),十字花科、鹽芥屬,野生型為兩年生草本,是一種耐鹽性強的鹽生植物,在我國主要分布于新疆、山東等鹽堿土壤區(qū)[1]。鹽芥形態(tài)類似擬南芥,其cDNA 序列與擬南芥也具有高度的同源性(90%~95%),因此,鹽芥被提出作為耐鹽模式植物[2~5]。近年來對鹽芥在生理和分子水平上耐鹽機制的研究受到廣泛關(guān)注,對其抗氧化酶[6,7] 、光合作用色素[8]及滲透與離子脅迫[9~11] 等方面的研究取得了重要進展。

脯氨酸是植物中廣泛存在的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),其作用是保持細胞與環(huán)境滲透平衡,防止水分散失,在鹽脅迫時它能與細胞內(nèi)的一些化合物形成聚合物,具有保水作用[12]?？扇苄缘鞍滓渤Ｗ鳛橹参锟鼓嫘灾笜?主動參與鹽脅迫時植物的滲透調(diào)節(jié),是除脯氨酸、可溶性糖外,植物中重要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[13] 。植物細胞內(nèi)存在清除氧自由基的酶促保護系統(tǒng)和非酶促的保護系統(tǒng),超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)是酶促保護系統(tǒng)中的重要組成[14～15]。 McCord和Fridovish 在1969年首先發(fā)現(xiàn)了超氧化物歧化酶(SOD),并證明其功能是清除超氧離子(O-?2),提出了氧毒害的超氧自由基假說[16]。此后在植物中不斷發(fā)現(xiàn)具有同樣功能的酶[17]和多種生物自由基及其傷害作用[18],進一步證實了這個假說。目前抗氧化酶系統(tǒng)的各種酶活性已經(jīng)成為衡量植物抗逆性的最重要指標之一。

本試驗測定了不同濃度NaCl脅迫下鹽芥和擬南芥中脯氨酸和可溶性蛋白含量以及抗氧化酶SOD、APX、POD、CAT活性,以探討鹽脅迫下兩種植物抗鹽相關(guān)生理指標特征,為研究鹽芥的耐鹽生理機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物的培養(yǎng)與處理

擬南芥,哥倫比亞生態(tài)型;鹽芥,采自山東東營。種子播種于土+蛭石+珍珠巖(4∶3∶1)的混合土中,用Hoagland營養(yǎng)液每3天澆一次。生長條件:每天光照16 h,黑暗8 h,光照強度為110 μmol/ m²?s,相對濕度為60%/80%(白天/晚上),溫度為23℃/18℃(白天/晚上)。生長4周后,采用鹽濃度每天遞增的方法,對擬南芥和鹽芥進行不同濃度NaCl處理,達到最終濃度后再處理1周測定生理指標。每處理重復(fù)3次,每重復(fù)10~12株苗。對照材料用完全Hoagland營養(yǎng)液澆灌,鹽處理材料用NaCl溶液處理,擬南芥NaCl溶液處理濃度為0、 50、100、150、200 mmol/L;鹽芥NaCl溶液處理濃度為0、50、100、150、200、 300 mmol/L。

1.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測定脯氨酸含量的測定:參照朱廣廉[19]的方法略作修改,取0.2 g鮮材料,加5%乙酸1 ml 和水10 ml研磨并過濾,取濾液4 ml,加沸石0.4 g,振蕩5 min后3 000 r/min離心10 min,取上清2 ml加冰醋酸2 ml及茚三酮2 ml,振蕩5 min后加熱1 h,再加入3 ml苯,充分振蕩,靜置分層,取上層有色部分于515 nm波長下比色?？扇苄缘鞍椎臏y定:參照鄒琦[20]的方法略作修改,取0.5 g葉片加5 ml pH 7.8的磷酸緩沖液冰浴研磨,12 000 r/min、4℃離心20 min,取0.1 ml上清液加0.9 ml去離子水,再加5 ml考馬斯亮藍G-250反應(yīng)2 min后于595 nm比色。

1.3 抗氧化酶系統(tǒng)酶活性測定

酶提取液制備:取0.5 g葉片加5 ml提取液(pH 7.8的磷酸緩沖液)冰浴研磨,12 000 r/min、4℃離心20 min,上清液即為酶提取液。

反應(yīng)液的配制:1.940 g Met、0.061 g NBT、0.019 g EDTA-2Na 、0.018825 g核黃素,用pH 7.8的 PBS定容至500 ml。

SOD的測定:參照Dhindsa[21]的方法略作修改,取0.5 ml酶提取液加3 ml反應(yīng)液在40 μmol/m²?s光強下反應(yīng)30 min,以不照光的為對照(以pH 7.8 PBS代替酶液,再加反應(yīng)液調(diào)0),用UV-160型分光光度計測定560 nm的OD值。

CAT的測定:參照張志良[22]的方法略作修改,取0.1 ml酶提取液加入2.9 ml反應(yīng)液(即 30% H₂O₂ 0.28 ml用pH 7.0 磷酸緩沖液定容至250 ml),在240 nm下比色。

APX的測定:參照Asada[23]的方法略作修改,取0.1 ml酶提取液加入2.9 ml反應(yīng)液(即30% H₂O₂ 55 μl加0.024 g ASA和0.019 g EDTA-2Na,用pH 7.0 PBS定容至500 ml (0/60),在290 nm下比色。

POD的測定:參照Omran[24]的方法略作修改,取30%酶提取液20 μl加入3 ml反應(yīng)液(即愈創(chuàng)木酚0.125 ml加30% H₂O₂ 0.25 ml,用pH 7.0磷酸緩沖液定容至250 ml(0/60),在470 nm下比色。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl處理對鹽芥和擬南芥滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

試驗結(jié)果(圖1)表明,經(jīng)不同濃度NaCl處理7天后,擬南芥的脯氨酸和可溶性蛋白含量均高于對照,且隨NaCl濃度的升高兩者的含量先增加,在100 mmol/L處理時達到最高,之后呈下降趨勢。而鹽芥隨鹽濃度升高逐漸積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),各處理間差異顯著。

可見,當NaCl處理濃度高于100 mmol/L時,鹽芥較擬南芥可積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),在150、200 mmol/L處理時,鹽芥的脯氨酸含量分別比擬南芥高43%和86%,可溶性蛋白含量分別高53%和120%。

2.2 不同濃度NaCl處理對鹽芥和擬南芥抗氧化酶系統(tǒng)的影響

由圖2可見,經(jīng)NaCl處理7天后,鹽芥的SOD、POD、CAT、APX活性均高于擬南芥。隨NaCl處理濃度的升高,擬南芥的SOD、POD活性均先升高后降低,100 mmol/L處理的活性最高,與其它處理的差異達顯著水平;200 mmol/L處理的活性最低,且均顯著低于其它處理。NaCl處理的鹽芥SOD、POD活性均高于對照,且隨NaCl濃度的升高,兩者的活性變化趨勢與擬南芥相似,均先升后降,并分別以150、200 mmol/L處理的活性最高;但SOD的變化較為平緩。