石運(yùn)慶 陳 高 孫 兵 單世華 陳 靜 苗華榮 胡曉輝

摘 要:利用植物抗病基因核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物,以抗、感黃曲霉病花生品種J11和金花1012的種皮基因組DNA和RNA為材料進(jìn)行DNA-PCR和RT-PCR擴(kuò)增,經(jīng)克隆、測(cè)序,得到一條504 bp的目的片段pnbs1,在GenBank上的登錄號(hào)為GQ199610。Blast和Blastx分析發(fā)現(xiàn)pnbs1核苷酸序列與C8V1G10F 抗性蛋白的核苷酸序列的同源性為89%,與抗性蛋白PLTR的氨基酸序列同源性為59%。該片段的氨基酸序列中含有抗病基因NBS區(qū)域的3個(gè)保守模體:GPGGVGKTT、KKFFIVLDDVW和STILLTTR,推測(cè)pnbs1可能是花生NBS類抗性基因的核心區(qū)域。

關(guān)鍵詞:花生種皮;NBS類抗病基因;克隆;序列分析

中圖分類號(hào):Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2009)12-0001-06

花生(Arachis hypogaea L.)是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物,為我國提供了豐富的花生制品和油脂[1]。雖然我國的花生產(chǎn)業(yè)在世界上占有非常重要的地位,總產(chǎn)、單產(chǎn)和出口量均居世界首位,但也面臨著諸如黃曲霉毒素污染、青枯病、褐斑病、葉斑病等問題[2,3],嚴(yán)重影響著我國花生產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。通過化學(xué)藥劑防治植物病害,會(huì)帶來病原物抗性和環(huán)境污染問題,其應(yīng)用受到越來越多的限制。篩選和培育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、有效、安全的防御病害的途徑,但傳統(tǒng)的抗病育種方法周期長、效率低[4]。利用分子標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)可以大大縮短選育抗病品種的時(shí)間,提高選育效率。

圖位克隆法和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法為經(jīng)典的植物抗病基因分離方法,適用于基因組較小的植物(如擬南芥、番茄等),對(duì)小麥、大豆、花生等植物則不適合[5]。已克隆的植物抗病基因在氨基酸水平上表現(xiàn)出了一定程度的相似性,在一些區(qū)段高度保守,如核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site, NBS)、亮氨酸拉鏈(leucine zippers, LZ)、富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats, LRR)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase, STK)、跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TM)及Toll白介素-1區(qū)域(Toll-interleukin-1 region, TIR)等。其中以NBS結(jié)構(gòu)域?yàn)橹?它能夠結(jié)合ATP或GTP,在植物抗病反應(yīng)中起重要作用[6,7]?？共』虻谋Ｊ匦允沟猛葱钥寺〕蔀榭赡?。同源克隆技術(shù)是近年來興起的基因分離技術(shù),目前已應(yīng)用于植物抗病基因及其同源物的分離,且已利用其從擬南芥、水稻、小麥、大麥、大豆、玉米、甘薯、黃瓜、番茄和香蕉等植物中分離了許多抗病基因同源片段[5～9,11～18]。

花生基因組較復(fù)雜且花生栽培種是異源4倍體,遺傳背景不清楚,與其它作物相比,花生抗病基因的分離相對(duì)滯后,但也已得到了一些抗性基因同源片段。Yuksel等(2005)[22]根據(jù)已知的抗病基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了4對(duì)兼并引物(PLTR、PNTR、PCF、PRGA)和2對(duì)特異引物(PCRE、PPTO),利用PLTR引物,獲得179個(gè)片段,經(jīng)Blast分析后只有95個(gè)片段有完整的開放閱讀框, 43個(gè)片段含有1個(gè)或多個(gè)終止密碼子。晏立英等(2007)[23]利用已克隆的植物抗病基因的NBS區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物或特異引物,從花生栽培種中花6號(hào)幼葉中獲得了5條具有連續(xù)ORF的抗病基因類似物(Resistance gene analogs, RGAs)序列。本研究根據(jù)已知的抗病基因NBS保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物,采用同源克隆技術(shù),試圖從抗、感黃曲霉病花生品種的種皮中分離出花生抗黃曲霉基因,進(jìn)而對(duì)該基因的組織結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性進(jìn)行分析研究,為功能性花生抗病基因的分離和遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

抗黃曲霉病花生品種J11和感病品種金花1012種植于日光溫室中,在莢果充實(shí)期取樣,以兩品種的種皮作為試驗(yàn)材料。

1.2 試劑

PCR反應(yīng)所需試劑,各種限制性內(nèi)切酶,凝膠回收試劑盒等,購自TIANGEN公司和TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 花生總DNA和總RNA提取

利用改良的SDS法[21]提取兩花生品種的種皮基因組DNA;采用TIANGEN公司的植物RNA提取試劑盒分別提取兩花生品種的種皮總RNA。

1.3.2 DNA-PCR擴(kuò)增

根據(jù)抗病基因產(chǎn)物的保守NBS結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)并合成以下引物:

正向Pf: GGACCTGGTGGGGTTGGGAAGACAAC;

反向Pr: CAACGCTAGTGGCAATCC。

DNA-PCR反應(yīng)條件:30 μl反應(yīng)體系包含10×buffer 3.0 μl,25 mmol/L MgCl2 2.0 μl,2.5 mmol/L dNTP 1 μl,(10 μmol/L)Pf 1 μl, (10 μmol/L)Pr 1 μl, 50 ng/L DNA模板1 μl。

反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性55 s,45～60℃退火45 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃后延伸10 min,4℃保存。

1.3.3 RT-PCR擴(kuò)增

引物同上。反應(yīng)條件:使用TaKaRa公司的RT-PCR試劑盒,50 μl體系,10×One Step RT-PCR Buffer 5 μl,One Step Enhancer Solution 1 μl, dNTP Mixture (均10 mmol/L)2 μl,RNase Inhibitor (40 U/μl) 1 μl,PrimeScriptTM RTnase (for 1 step) 0.5 μl,TaKaRa Ex TaqTM HS(5 U/L)1 μl,上游引物(10 μmol/L)1 μl,下游引物(10 μmol/L)1 μl,Total RNA 1 μl。

反應(yīng)程序:50℃ 30 min;94℃ 2 min,94℃ 30 s,55～65℃ 30 s,30 循環(huán);72℃ 1 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的克隆

使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,用BioFlux公司的凝膠回收試劑盒回收目的帶,連接到pBS-T載體上,轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選,挑取陽性單菌落(白斑)搖菌培養(yǎng),用TIANGEN公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒,用HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切。

1.3.5 序列測(cè)定和分析

測(cè)序委托TIANGEN公司和三博遠(yuǎn)志公司完成。序列分析用BLAST和DNAMAN等軟件,所用數(shù)據(jù)庫為GenBank。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生中NBS類抗病基因同源片段的分離

以抗黃曲霉病花生品種J11和感病品種金花1012的種皮基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后在兩材料上出現(xiàn)一條與預(yù)期大小相符的500 bp左右的條帶(圖1),以及2條分子量較小的條帶。以兩品種種皮RNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后在兩材料上都僅得到一條500 bp左右條帶(圖2)。

含有目的帶的重組子經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后出現(xiàn)兩條帶,分別為目的帶和載體帶(見圖3)。

2.2 同源片段的核苷酸序列分析

從重組子中任意挑選5個(gè)測(cè)序。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn),目的片段長504 bp,命名為pnbs1,GenBank登錄號(hào)為GQ199610。經(jīng)Nucleotide blast分析發(fā)現(xiàn)pnbs1核苷酸序列與野生種Arachis cardenasii C8V1G10F的抗性蛋白假基因的核苷酸序列的同源性為89%(圖4),推測(cè)pnbs1可能是花生抗性基因的部分序列。

2.3 同源片段的氨基酸序列分析

Blastx分析發(fā)現(xiàn)pnbs1與抗性蛋白PLTR的氨基酸序列同源性為59%,在NBS保守區(qū)域和疏水結(jié)構(gòu)域氨基酸序列基本相同(圖5)。

2.4 同源片段的NBS保守區(qū)域分析

根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)的pnbs1氨基酸序列中含有抗病基因NBS區(qū)域的3個(gè)保守模體:磷酸結(jié)合環(huán)(p-loop)GPGGVGKTT,激酶2a KKFFIVLDDVW,激酶3a STILLTTR(圖6)。同時(shí)將pnbs1的這3個(gè)保守區(qū)與大豆的SR1基因、煙草的N基因、亞麻的L6基因和擬南芥的Rps2的保守區(qū)進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果見表1。

3 討論

黃曲霉毒素是黃曲霉菌(Aspergillus flavus)侵染花生等作物后產(chǎn)生的對(duì)人體有極強(qiáng)致癌作用的次生代謝物質(zhì),黃曲霉毒素污染一直是制約我國花生出口增長的重要因素。選育抗黃曲霉菌的花生品種是最經(jīng)濟(jì)有效的途徑?；ㄉN皮是抵抗黃曲霉侵染的天然屏障,種皮的完整性有利于提高黃曲霉抗性[25]。單世華等(2007)[26]利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行了抗、感黃曲霉菌差異基因表達(dá)分析研究,發(fā)現(xiàn)在種皮發(fā)育階段抗、感花生種皮中存在大量的差異表達(dá)基因。

本研究根據(jù)已知抗性基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,從花生的種皮中獲得了一條抗性基因片段pnbs1,經(jīng)Nucleotide blast分析發(fā)現(xiàn)pnbs1核苷酸序列與Arachis cardenasii 的C8V1G10F核苷酸序列的同源性為89%。Blastx分析發(fā)現(xiàn)pnbs1與抗性蛋白PLTR的氨基酸序列同源性為59%,該抗性片段的氨基酸序列中含有已知抗病基因NBS區(qū)域的3個(gè)保守模體磷酸結(jié)合環(huán)(p-loop)、激酶2a和激酶3a,另外,C-末端還有疏水結(jié)構(gòu)域。因此,推測(cè)pnbs1很可能就是花生的NBS類抗性基因的核心區(qū)域。

本試驗(yàn)利用設(shè)計(jì)的特異引物,從花生種皮的DNA和RNA中都獲得了一條目的帶,經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)兩條序列完全相同,證明pnbs1序列中沒有內(nèi)含子;該基因的核心片段在抗黃曲霉病花生品種和感病品種中完全相同。pnbs1核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列的3個(gè)保守區(qū)與大豆的SR1基因、煙草的N基因、亞麻的L6基因和擬南芥的Rps2的保守區(qū)比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)它們具有很大的同源性。推測(cè),NBS類抗黃曲霉病基因可能是一類組成型表達(dá)的基因[27],以多基因家族的形式存在于染色體上[6],在抗病品種染色體上的拷貝數(shù)多于在感病品種上的拷貝數(shù);或此基因可能是非抗黃曲霉病的NBS類抗性基因,這需要通過RACE技術(shù)獲得全長序列后進(jìn)行原核表達(dá)或轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

參 考 文 獻(xiàn):

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