白玉紅　陳小帆　于海威　韓　慧

[摘要] 目的:建立痔特佳片微生物限度檢查方法,并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。方法:采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法。結(jié)果:痔特佳片用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行微生物限度的細(xì)菌檢查。結(jié)論:確立了微生物限度檢查方法,保證微生物限度檢查方法的有效性。

[關(guān)鍵詞] 痔特佳片;微生物限度檢查;方法驗(yàn)證

[中圖分類(lèi)號(hào)]R286[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B [文章編號(hào)]1674-4721(2009)07(b)-136-02

痔特佳片是由槐角(炒),地榆炭、黃芩、當(dāng)歸、枳殼、防風(fēng)、鞣質(zhì)等8種成分組成的中藥復(fù)方制劑。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未列微生物限度的檢查方法。本文按照《中國(guó)藥典》2005年版[1]和中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[2]及有關(guān)文獻(xiàn)[3-5],建立了痔特佳片微生物限度檢查方法,方法經(jīng)驗(yàn)證有效可行。

1 材料

1.1培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,改良馬丁培養(yǎng)基(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。稀釋劑為0.9%滅菌氯化鈉溶液,pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液(本所配置)。

1.2 藥品

痔特佳片(營(yíng)口宏生藥業(yè)有限公司,批號(hào):20060117)。

1.3菌種

大腸埃希菌[CMCC(B)44102],金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003],枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501],白色念球菌[CMCC(F)98001],黑曲霉菌[CMCC(F)98003],由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

2 試驗(yàn)部分

2.1菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,35～37℃培養(yǎng)18～24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,23～28℃培養(yǎng)24～48 h。再分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成每毫升含50～100 cfu的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,23～28℃培養(yǎng)5～7 d,使大量的孢子產(chǎn)生,加入3～5 ml的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液,孢子洗脫,吸出孢子菌液至滅菌試管內(nèi),稀釋至每毫升含50～100 cfu的菌懸液。

2.2 供試液的制備

取供試品10 g,加稀釋劑100 ml,制成1∶10供試液備用。

2.3試驗(yàn)方法

2.3.1常規(guī)法:采用1 ml/皿的供試液。

2.3.2培養(yǎng)基稀釋法:采用0.2 ml/皿的供試液。

2.4回收率測(cè)定(驗(yàn)證試驗(yàn)分4組,至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn),并分別計(jì)算各次試驗(yàn)的菌回收率)

2.4.1試驗(yàn)組:取1∶10的供試液和試驗(yàn)菌液各1 ml,分別注入兩個(gè)平皿,立即注入45℃的融化的相應(yīng)的培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20 ml,搖勻,凝固后,將平板倒置于規(guī)定的溫度培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間,做菌落計(jì)數(shù)。

2.4.2菌液組:取上述試驗(yàn)菌液,測(cè)定其加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。

2.4.3供試液對(duì)照組:測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.4.4稀釋劑對(duì)照組:用相應(yīng)的稀釋劑代替供試品,加入試驗(yàn)菌液,使最終菌濃度為1 ml含50~100 cfu,按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌數(shù)計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。

2.4.5結(jié)果判斷:實(shí)驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均應(yīng)不低于70%。

3 試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

根據(jù)結(jié)果判斷,從表1可見(jiàn),稀釋劑的菌回收率均在70%以上。從表2可見(jiàn),痔特佳片用常規(guī)法,金黃色葡萄球菌的回收率低于70%,說(shuō)明該樣品對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用,但用培養(yǎng)基稀釋法,五種菌的回收率均高于70%。因此,可用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行痔特佳片的微生物限度檢查。

操作過(guò)程的各環(huán)節(jié)對(duì)回收率有影響。應(yīng)注意培養(yǎng)基溫度,建議用水浴保溫效果好。菌落計(jì)數(shù)誤差對(duì)驗(yàn)證方法的影響:當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)小而密集時(shí),極易產(chǎn)生計(jì)數(shù)誤差,故菌落計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)仔細(xì)觀察,必要時(shí)借助放大鏡或低倍顯微鏡,如難區(qū)別,可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2005:一部附錄71-78,二部附錄93-101.

[2]中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005:二部325-331.

[3]馬越,特玉香.16種中成藥微生物限度檢查法方法驗(yàn)證[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2005,6(6):356-359.

[4]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:61-65.

[5]王知堅(jiān),邵惠琴,杜蕓,等.藥品微生物限度檢查法有效性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2004,21(3):211-213.

(收稿日期:2009-04-22)