王　林　李　平　賈海峰　張國(guó)華

[摘要] 目的:觀察體外沖擊波(ESW)干預(yù)兔骨缺損模型后成骨細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)情況,初步探討其促進(jìn)成骨作用的分子生物學(xué)機(jī)制。方法:將18只中國(guó)健康家兔制備雙橈骨骨缺損動(dòng)物模型,右上肢作為實(shí)驗(yàn)組,左上肢為對(duì)照組,1周后全麻下行右上肢ESW治療,左上肢不做治療。定期拍X線片、組織學(xué)觀察、免疫組化檢測(cè)。結(jié)果:①X線光片顯示沖擊波治療4、6周后,治療組骨愈合較對(duì)照組好;②組織學(xué)觀察顯示治療組骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞增生活躍;③免疫組化方法示治療組成骨細(xì)胞中VEGF含量明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:ESW干預(yù)后成骨細(xì)胞中生物學(xué)活性因子VEGF表達(dá)增加,可能是ESW促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨活動(dòng)的有力證據(jù)。

[關(guān)鍵詞] ESW;成骨細(xì)胞;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子;骨缺損

[中圖分類號(hào)] R682.1+7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1674-4721(2009)07(a)-023-02

根據(jù)ESW物理特性開展的ESW療法( ESWT) 已被廣泛的用于骨科慢性軟組織損傷的非手術(shù)治療。近些年,國(guó)內(nèi)外又有學(xué)者將ESWT用于成人早期股骨頭缺血性壞死的保守治療[1-2],但ESW療法治療骨骼肌系統(tǒng)疾病的機(jī)理仍不清楚。目前有關(guān)沖擊波干預(yù)骨缺損模型后成骨細(xì)胞中VEGF表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本研究在制作兔骨缺損模型和測(cè)知理想沖擊波干預(yù)能量的基礎(chǔ)上,觀察ESW干預(yù)后成骨活性因子VEGF的表達(dá),探討ESW的促成骨作用,為進(jìn)一步擴(kuò)展ESW療法治療成骨障礙性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HB-ESWL-VG型多功能沖擊波碎石機(jī),VEGF抗體。

1.2 兔骨缺損模型的制取

參考林博文等[3]兔橈骨骨缺損模型制備方法,選取健康中國(guó)家兔18只,用10%水合氯醛液按3 ml/kg體重行耳緣靜脈麻醉,拍X線片觀察模型制作情況。

1.3 受試對(duì)象的分組及干預(yù)

每只家兔均以右上肢為實(shí)驗(yàn)組,左上肢為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行ESW治療,對(duì)照組不加干預(yù)。

1.4 X線檢查

沖擊波治療后,在第4、6周分別行骨缺損X線拍片,觀察骨缺損愈合情況。

1.5 組織學(xué)檢查

分別于沖擊波治療后第4周、6周時(shí)各取9只動(dòng)物處死,均取原骨缺損部位組織進(jìn)行脫鈣、固定、石蠟包埋,HE染色后光鏡檢查組織情況。

1.6 免疫組化染色

采用SABC免疫組化染色法,觀測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)VEGF的表達(dá)。具體步驟依試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。計(jì)算光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,行光密度值t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 X線檢查

動(dòng)物模型制備成功后,X線檢查符合標(biāo)準(zhǔn)。橈骨骨缺損約1 cm,兩斷端邊緣整齊。沖擊波治療后第4、6周實(shí)驗(yàn)組骨痂形成較對(duì)照組明顯。4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組骨痂形成多于對(duì)照組;6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組骨痂髓腔形成較對(duì)照組明顯。

2.2 組織學(xué)檢查結(jié)果

2.2.1 沖擊波治療4周時(shí)兩組組織學(xué)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)組:骨外膜大量成骨細(xì)胞聚集,呈柵欄狀排列,其胞核大,深藍(lán)色,圓形或呈柱狀?？梢娸^多的成纖維細(xì)胞散在于成骨細(xì)胞間。原骨缺損纖維連接處見間充質(zhì)細(xì)胞呈活躍增生,大量排列有序的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞核濃染,細(xì)胞處于活躍增生狀態(tài);對(duì)照組:骨折端仍為纖維組織,表現(xiàn)為一些均質(zhì)樣物質(zhì),少量的有形細(xì)胞。

2.2.2 沖擊波治療6周時(shí)兩組組織學(xué)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)組:新生骨小梁開始形成,成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞成骨,逐漸包埋于骨陷窩內(nèi);對(duì)照組:新生骨小梁稀疏,仍主要為慢性炎癥反應(yīng)和纖維組織。

2.3 免疫組化檢查

實(shí)驗(yàn)組:4周時(shí)可見較多小血管增生,大量成骨細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞漿黃染陽(yáng)性表現(xiàn)。6周時(shí)較少新生小血管增殖,較多血管成骨細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞漿黃染陽(yáng)性表現(xiàn);對(duì)照組:4周和6周時(shí)僅少量成骨細(xì)胞出現(xiàn)VEGF陽(yáng)性表達(dá)。將4、6周實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的免疫組化切片行光密度值分析,并進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn),其P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示ESW治療4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組TGF-β1表達(dá)仍高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

近些年國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試將ESWT用于早期成人股骨頭缺血性壞死的保守治療,取得了較好的療效[3]。但對(duì)其分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚,可能與其調(diào)節(jié)多種活性細(xì)胞生長(zhǎng)因子有關(guān)。Geiger F等[4]報(bào)道在骨折、傷口愈合、組織修復(fù)、各種腫瘤細(xì)胞中都有VEGF的表達(dá),上述產(chǎn)生VEGF的病理生理過(guò)程的共同特點(diǎn)是均有新生血管的生成和組織高度血管化。一個(gè)較為完善的血管網(wǎng)對(duì)于骨形成是非常必要的,它不僅能提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣,還能輸送成骨前體細(xì)胞,分泌成骨細(xì)胞所需的生長(zhǎng)因子。因此誘導(dǎo)骨折后VEGF的表達(dá)對(duì)骨折的早期愈合具有重要的意義。目前關(guān)于VEGF的研究主要是對(duì)腫瘤的影響,而對(duì)骨折愈合的作用也引起相關(guān)學(xué)科的重視,研究發(fā)現(xiàn)其和骨形成有著直接的關(guān)系[5]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沖擊波治療后對(duì)照組中VEGF呈弱陽(yáng)性表達(dá),說(shuō)明VEGF在正常成骨細(xì)胞中作用不大,需要有效的刺激促進(jìn)其表達(dá),而實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞中VEGF的表達(dá)在第4、6周時(shí)與對(duì)照組比較,陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的血管增生較對(duì)照組活躍,由此我們推測(cè)ESW可能通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)血管增生,加速骨折愈合?？傊?ESW在促進(jìn)骨折愈合方面其機(jī)制十分復(fù)雜,它可以促進(jìn)VEGF及其他各細(xì)胞因子的表達(dá),再通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在某種正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制下,相互作用、相互影響促進(jìn)成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的增殖分化,促進(jìn)骨折愈合,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]邢更彥,白曉東,杜明奎,等.ESW治療成人股骨頭缺血性壞死的療效觀察[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志[J].2003,25:472-474.

[2]Ludwig J,Lauber S,Lauer HJ,et al.High energy extracorporeal shock wave therapy of femoral head necrosis in adults[J].Clin Orthop,2001,387:192-126.

[3]林博文,徐忠世.實(shí)驗(yàn)性骨不連模型的制作[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(5):331-335.

[4]Geiger F,Bertram H,Berger I.Vascular endothelial growth factor gene-activated matrix(VEGF165-GAM) enhances osteogenesis and angio-genesis in large segmental bone defects[J].Bone Miner Res, 2005,20(11):28-35.

[5]Wang M,Zhang W,Crisostomo P,et al.STAT3 mediates bone marrow mesen-chymal stem cell VEGF production[J]. J Mol Cell Cardiol,2007,42(6):9-15.

(收稿日期:2009-04-27)