摘 要 目的：建立比濁法測定硫酸抗敵素效價的方法。 方法：確定比濁法測定硫酸抗敵素的線性范圍，在線性范圍內(nèi)選擇高、低劑量對硫酸抗敵素進(jìn)行效價測定，并與管碟法效價測定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果與結(jié)論：比濁法與管碟法測定結(jié)果無明顯差異，比濁法測定硫酸抗敵素效價具有精確、便捷等特點，可用于產(chǎn)品質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 效價 比濁法 管碟法 硫酸抗敵素

中圖分類號：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1006-1533(2008)11-0519-03

Turbidimetric method in the determination of titer of colistin sulfate

Bian Jinni， Cao Qiong， Li Ping

(Shanghai Xinxianfeng Pharmaceutical Co， Shanghai，201203)

ABSTRACT Objective:

To establish turbidimetric method to determine the titer of colistin sulfate. Methods: The linear range of colistin sulfate by turbidimetric method was measured and the titer of colistin sulfate at high and low dose in the linear range was tested andthe testing results were compared with those of diffusion method. Results and Conclusion: There was no significant difference between turbidimetric and diffusion method. Turbidimetric method can be used for quality control for its accuracy and convenience.

KEY WORDS turbidimetric method; diffusion method; colistin sulfate

國際上一般采用比濁法和管碟法并行的方法來進(jìn)行微生物效價測定。兩者都是通過比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的抑菌能力來測定藥物的抗菌能力。比濁法是《中華人民共和國藥典(2005年版)》的新增項目。與管碟法相比較，雖然比濁法在檢驗品種上受到一定的限制，但其具有較高精確性和重現(xiàn)性，并且操作簡便，可明顯縮短實驗時間。尤其對中間產(chǎn)品的檢驗具有重要意義。本文建立了比濁法測定硫酸抗敵素效價的方法，并與管碟法進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 儀器

722光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠）；CP225D電子天平（Sartoris公司）；HHS-21-6恒溫水浴鍋（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司），HHBII-600恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

抗生素檢定培養(yǎng)基III（北京三藥科技開發(fā)公司，批號：070122）；磷酸氫二鉀（廣東光華化學(xué)廠，批號：20050321）；磷酸二氫鉀（廣東光華化學(xué)廠，批號：20031007）；營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司，批號：070409）；12%甲醛（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司 ，批號：071030）。

1.3 菌株

大腸桿菌(E. coli 44103)（中國藥品生物制品檢定所）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品與對照品

硫酸抗敵素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：130327-200305，效價：22 106 u/mL）；硫酸抗敵素原料藥

（上海新先鋒藥業(yè)有限公司，批號：2004-06-06，效價：19 783 u/mL；上海新先鋒藥業(yè)有限公司，批號：2004-06-07，效價：20 356 u/mL）；

注射用硫酸抗敵素（上海新先鋒藥業(yè)有限公司，批號：060505，效價：19 877 u/mL；上海新先鋒藥業(yè)有限公司，批號：060506，效價：19 482 u/mL）。

2 方法

2.1 檢定培養(yǎng)基的制備

稱取抗生素檢定培養(yǎng)基III 19 g，加入1 000 mL水，加熱煮沸至完全溶解，過濾，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，115℃滅菌30 min后備用。

2.2 pH 6.0磷酸緩沖液的制備

稱取2.6 g磷酸氫二鉀與8 g磷酸二氫鉀，加入1 000 mL水，溶解后115℃滅菌30 min后備用。

2.3 含菌培養(yǎng)基的制備

取大腸桿菌培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用10 mL滅菌水洗下菌苔，置于試管中，加入適量滅菌水稀釋，使其在650 nm波長處的吸光度為1.0［1］。取0.7 mL菌懸液加入100 mL抗生素培養(yǎng)基III中，充分混勻后備用［2］。

2.4 比濁法線性范圍的測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)［3］設(shè)計線性實驗，以20 u/mL作為中心濃度，劑間比為1.25，線性實驗劑量依次為：12.8 u/mL、16 u/mL、20 u/mL、25 u/mL、31.3 u/mL。

稱取適量硫酸抗敵素標(biāo)準(zhǔn)品，用pH 6.0磷酸緩沖液溶解并稀釋至1 000 u/mL［4］，分別取適量該標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用pH 6.0磷酸緩沖液稀釋至12.8 u/mL、16 u/mL、20 u/mL、25 u/mL、31.3 u/mL。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL置于滅菌后的試管中（每個濃度5管），于每管中加入9 mL含0.7 %菌懸液的培養(yǎng)基，立即搖勻，放入36℃恒溫水浴中培養(yǎng)4 h［1，6］。另取一支試管加入10 mL含0.7 %菌懸液的培養(yǎng)基與0.5 mL的12 %甲醛，放入冰箱，作為空白對照。將試管取出后，立即放入冰水浴中，加入0.5 mL的12%甲醛［5］，于530 nm波長處測量其吸光度。

2.5 效價測定

根據(jù)線性范圍實驗結(jié)果設(shè)計實驗。低劑量為13 u/mL，高劑量為26 u/mL，劑間比為2∶1。

分別稱取適量硫酸抗敵素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品，用pH 6.0磷酸緩沖液溶解并稀釋至1 000 u/mL［4］，分別取適量該標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液，用pH 6.0磷酸緩沖液稀釋至13 u/mL、26 u/mL。分別量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL置于試管中（每個濃度5管），于每管中加入9 mL培養(yǎng)基菌液，立即搖勻，放入36℃恒溫水浴中培養(yǎng)4 h［3］。另取一支試管加入10 mL含0.7 %菌液的培養(yǎng)基與0.5 mL的12 %甲醛，放入冰箱，作為空白對照。將試管取出后，立即放入冰水浴中，加入0.5 mL的12 %甲醛，于530 nm波長處測量其吸光度，根據(jù)《中華人民共和國藥典(2005年版)》方法計算結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1比濁法線性范圍

根據(jù)2.4項中方法確定比濁法的線性范圍，以劑量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，如圖1所示。



劑量濃度的對數(shù)值與OD530的線性關(guān)系可采用方程：y =﹣0.185x﹢0.680 5，R2 = 0.990 2描述。結(jié)果表明，在12.8 u/mL～31.3 u/mL范圍內(nèi)劑量濃度對數(shù)值與吸光度線性關(guān)系良好，因此可進(jìn)一步在該范圍內(nèi)選擇比濁法效價測定的高、低劑量。

3.2 效價測定

根據(jù)2.5項中方法對硫酸抗敵素的效價進(jìn)行測定，比濁法效價測定結(jié)果與管碟法效價測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表1。

2批數(shù)據(jù)結(jié)果相似，因此采用1批數(shù)據(jù)作為結(jié)果統(tǒng)計。 由以上結(jié)果可以得出：管碟法與比濁法效價測定結(jié)果并無較大差異，比濁法可信限優(yōu)于管碟法。 

3.3 重現(xiàn)性測定和回收率實驗

通過計算每批樣品效價測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，對比濁法與管碟法的重現(xiàn)性進(jìn)行分析。表2所示的RSD分析表明，比濁法重現(xiàn)性較好。

為了進(jìn)一步比較比濁法和管碟法的測定效果，對兩種方法的回收率進(jìn)行比較(見表3)。結(jié)果表明比濁法具有較好的回收率。

4 討論

4.1 高、低劑量的確定

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，通常高劑量的吸光值測定結(jié)果比低劑量的吸光值測定結(jié)果穩(wěn)定。這是由于實驗中藥品濃度較低，從而使稀釋過程中的誤差對實驗結(jié)果造成了一定的影響。藥品濃度越低，誤差對實驗結(jié)果影響越大。因此在選擇高、低劑量濃度時，應(yīng)盡量在線性范圍內(nèi)選擇較高濃度進(jìn)行效價測定。本實驗中選擇低劑量為13 u/mL、高劑量為26 u/mL，劑間距為2∶1，符合《中華人民共和國藥典(2005年版)》規(guī)定。

4.2 比濁法與管碟法對比

從表1的實驗結(jié)果可以看出，比濁法與管碟法的測定結(jié)果并無明顯差異。但比濁法可信限明顯優(yōu)于管碟法。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，管碟法有時會出現(xiàn)抑菌圈邊緣不清晰、測量結(jié)果不穩(wěn)定等情況。在比濁法法實驗過程中，瓊脂中含有的雜質(zhì)往往影響了藥品擴散速度從而導(dǎo)致實驗結(jié)果不穩(wěn)定，同時手工滴加藥品也會使抑菌圈測量結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差。而比濁法采用儀器測定，具有較高的精密度和靈敏度，因此其實驗結(jié)果則相對較穩(wěn)定。同時，RSD與回收率的分析結(jié)果也表明了比濁法具有較高的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。

4.3 影響比濁法實驗準(zhǔn)確性的因素

在比濁法效價測定實驗過程中必須注意以下細(xì)節(jié)，以保證實驗準(zhǔn)確性：實驗用菌液必須在實驗當(dāng)天制備完成，在培養(yǎng)前應(yīng)搖勻試管，使菌液與藥品均勻分布于試管中，以免造成實驗數(shù)據(jù)混亂；實驗中所用的培養(yǎng)基必須色澤澄清，培養(yǎng)基中含有的雜質(zhì)會影響實驗的準(zhǔn)確性，因此培養(yǎng)基必須經(jīng)過濾、滅菌后方可使用；在培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)立即將試管放入冰水浴中，使試驗菌同時停止生長，然后再加入12 %甲醛溶液，以避免由于試驗菌停止生長不同步而產(chǎn)生的誤差；實驗中應(yīng)選擇大小、厚度均一的試管，使各個試管中的培養(yǎng)物均衡受熱，減小實驗誤差。

參考文獻(xiàn)

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(收稿日期：2008-02-21)