[摘要]目的：探討NOS2基因－954 G→C位點(diǎn)多態(tài)性與白癜風(fēng)發(fā)病的相關(guān)性。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法，對(duì)749例白癜風(fēng)患者和763例健康人的NOS2基因－954 G→C位點(diǎn)基因型進(jìn)行分析。結(jié)果：白癜風(fēng)患者NOS2－954 G→C位點(diǎn)基因型的分布與正常對(duì)照組相比有顯著性差異，聯(lián)合基因型GC+CC及C等位基因在白癜風(fēng)患者中頻率較高，與臨床資料結(jié)合分析表明聯(lián)合基因型GC+CC在在發(fā)病年齡大于20歲組、活動(dòng)期患者、皮節(jié)型白癜風(fēng)及伴有自身免疫病和正常對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但在發(fā)病年齡小于20歲組、穩(wěn)定期患者、尋常型白癜風(fēng)及無(wú)自身免疫病組的分布頻率與正常對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論：NOS2－954 G→C位點(diǎn)基因多態(tài)性與白癜風(fēng)有明顯的相關(guān)性。攜帶C等位基因可能會(huì)增加對(duì)白癜風(fēng)的易感性。

[關(guān)鍵詞]NOS2，基因多態(tài)性，白癜風(fēng)

[中圖分類號(hào)]R511.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)嗎]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）08-1173-03

Study on the association between NOS2 polymorphism and vitiligo

ZHANG Ying，LIU Ling，LI Kai，LI Chun-ying，YANG Li，SUN Lin-chao，GAO Tian-wen

(Institute of Dermatology of Chinese PLA，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032 ，Shaanxi，China)

Abstract：ObjectiveObjective to investigate the association between NOS2－954 G→C polymorphism and vitiligo in Han Chinese people． MethodsNOS2－954 genotypes of 749 vitiligo patients and 763 healthy controls were tested by PCR-RFLP． ResultsWe found a statistical significant association between NOS2－954 C allele and vitiligo (P<0.05).ConclusionNOS2 -954 polymorphism is association with vitiligo．The C allele will increase the susceptibility of vitiligo．

Key words：vitiligo， NOS2， gene polymorpythism

白癜風(fēng)是一種選擇性毀損黑素細(xì)胞的色素脫失性疾病，表現(xiàn)為皮膚局部白斑。目前白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說(shuō)，包括自身免疫學(xué)說(shuō)、神經(jīng)學(xué)說(shuō)、黑素細(xì)胞自身破壞學(xué)說(shuō)、遺傳學(xué)說(shuō)、黑素細(xì)胞生長(zhǎng)因子缺乏學(xué)說(shuō)等[1-3]。隨著對(duì)白癜風(fēng)研究的不斷深入，大多傾向認(rèn)為本病是一種多基因遺傳背景下的自身免疫性疾病，是一種多因素疾病。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，遺傳易感性（基因多態(tài)性）與白癜風(fēng)易感性之間存在相關(guān)性，白癜風(fēng)易感基因的研究成為了熱點(diǎn)。NOS2基因編碼人類誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible notric oxide synthase），在內(nèi)毒素或其它細(xì)胞因子如TNF、IFN、IL-1、IL-6等誘導(dǎo)下， iNOS活化生成一氧化氮(NO)，一氧化氮是一種細(xì)胞間信使，近年來(lái)又被看作是一種細(xì)胞毒效應(yīng)分子，可參與自身免疫病的發(fā)病，其合成和生物學(xué)效應(yīng)受多種細(xì)胞因子調(diào)控[4]。一氧化氮可能通過(guò)參與黑素細(xì)胞破壞和調(diào)節(jié)自身免疫在白癜風(fēng)發(fā)病中起作用[5]。既往文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)NOS2 啟動(dòng)子區(qū)-954G→C突變能增加iNOS活性，促使體內(nèi)生成大量NO[6-7]?，F(xiàn)尚無(wú)該位點(diǎn)多態(tài)性與白癜風(fēng)發(fā)病的相關(guān)報(bào)導(dǎo)，本研究中，我們對(duì)NOS2-954G→C單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)漢族白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)系進(jìn)行深入研究。

1材料和方法

1.1 研究對(duì)象：患者組標(biāo)本來(lái)自2005年6月～2006年6月第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚性病科門(mén)診，均符合中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組2003年白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)[8]。健康對(duì)照選取自同一時(shí)期在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院健康查體者，沒(méi)有白癜風(fēng)家族史，無(wú)腫瘤、風(fēng)濕病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等?；颊呓M平均年齡(24.7±l3.6)歲，對(duì)照組平均年齡(26.4±13.3)歲(P=0.703)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取:抽取白癜風(fēng)患者及正常對(duì)照外周靜脈血(檸檬酸抗凝)5 ml，用DNA提取試劑盒(離心柱型，由北京天為時(shí)代科技有限公司提供)按說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定DNA純度，置-80℃保存待用。

1.2.2 NOS2基因型分析：運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分析NOS2基因型。

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)：北京奧科有限公司合成，引物序列參照文獻(xiàn)[6]。序列：PF：5'-CAT ATG TAT GGG AAT ACT GTA TTT CAG-3'， PR：5'-TCT GAA CTA GTC ACT TGA GG-3'。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增：反應(yīng)總體系20ul，含基因組DNA約50ng，20pm/L引物各0.5μl。PCR條件：95℃預(yù)變性3min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物大小573bp。

1.2.2.3酶切：在2μl PCR產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶Bsa I 5U(美國(guó)NEB公司)，10×緩沖液1μl，去離子水補(bǔ)至10 μl，50℃酶切5 h，3%瓊脂糖（含溴化乙錠）凝膠電泳分離鑒定酶切產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：分別統(tǒng)計(jì)病例組和對(duì)照組基因型和等位基因的分布頻率。數(shù)據(jù)經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)后，用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用卡方檢驗(yàn)，比較白癜風(fēng)患者組和對(duì)照組NOS2基因型分布上的差異，并分析NOS2基因型與白癜風(fēng)臨床資料的相關(guān)性。

2結(jié)果

2.1 基因型確定：PCR-RELP產(chǎn)物電泳檢測(cè)顯示三種基因型（圖1）：野生型GG（446bp、127bp）、雜合子GC型（573bp、446bp和127bp）、突變CC型（573bp）。

2.2 基因型及等位基因分布頻率：3種基因型在所研究漢族正常對(duì)照群體中的分布經(jīng)Hardy-Weinberg定律吻合度檢測(cè)，達(dá)到遺傳平衡（P＝0.133），說(shuō)明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w，證實(shí)抽樣和分型結(jié)果可靠。如表1所示： GG，GC，CC三種基因型頻率在白癜風(fēng)患者中分別占83.44%，15.35%和1.2%；在健康對(duì)照中分別占87.42%，11.80%和0.79%。GC和CC基因型在白癜風(fēng)患者中的頻率高于正常對(duì)照組(P=0.029)。C等位基因頻率在白癜風(fēng)患者中高于正常對(duì)照組（8.9%vs.6.7%，P=0.028）。

2.3 基因型及等位基因分布頻率與臨床資料關(guān)系：如表2所示，患者組聯(lián)合基因型Logistic回歸分析提示與野生型基因型GG相比，聯(lián)合基因型GC+CC會(huì)增加罹患白癜風(fēng)的危險(xiǎn)性，GC+CC調(diào)整的比值比（aOR）和95%可信區(qū)間（95%CI）：1.352 (1.013-1.805)。GC+CC在不同性別及是否伴隨家族史中無(wú)顯著差別（P＞0.05），在發(fā)病年齡小于20歲組、穩(wěn)定期患者、尋常型白癜風(fēng)及無(wú)自身免疫病組的分布頻率與正常對(duì)照組有差別（P＜0.05），但在發(fā)病年齡大于20歲組、活動(dòng)期患者、皮節(jié)型白癜風(fēng)及伴有自身免疫病和正常對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。Logistic回歸分析顯示聯(lián)合基因型GC+CC增加了對(duì)尋常型和不伴有自身免疫病白癜風(fēng)的易感性。尋常型GC+CC調(diào)整的比值比（aOR）和95%可信區(qū)間（95%CI）：1.358 (1.014～1.820)，不伴有自身免疫病GC+CC調(diào)整的比值比（aOR）和95%可信區(qū)間（95%CI）：1.383 (1.035～1.849)。

3討論

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)能催化L-精氨酸生成一氧化氮(NO)，NO具有多種生物學(xué)功能，包括神經(jīng)傳遞、血管擴(kuò)張、血小板粘附和淋巴細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)，近來(lái)又被看作是一種細(xì)胞毒效應(yīng)分子，在組織特異性自身免疫的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[8]。NO作為一種多功能介質(zhì)，有可能通過(guò)破壞黑素細(xì)胞、參與自身免疫等環(huán)節(jié)在白癜風(fēng)的發(fā)病中起作用。既往研究顯示，在脂多糖和細(xì)胞因子刺激下，NO可引起正常培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞自身破壞，導(dǎo)致色素脫失[9]；NO除直接對(duì)黑素細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，還可影響黑素細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)的粘連，從而引起白癜風(fēng)中黑素細(xì)胞的破壞[10]。此外，NO參與炎癥與自身免疫介導(dǎo)的組織損傷[11-12]，它可通過(guò)影響自身免疫性疾病中TH1/TH2的平衡來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在高濃度下，能夠直接破壞健康組織，直接參與自身免疫性疾病的發(fā)生，還可以通過(guò)一些繼發(fā)反應(yīng)，如毒性自由基的產(chǎn)生，誘導(dǎo)促炎癥的細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子－(TNF-)、IL-1）生成，使血管通透性增加等間接參與自身免疫性損害。NO是否通過(guò)自身免疫而在白癜風(fēng)的發(fā)病中起作用，值得我們進(jìn)一步研究。

人類NOS2基因位于17號(hào)染色體q12，其啟動(dòng)子區(qū)域含有多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，也是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性所必需的。Kun等[6]報(bào)導(dǎo)-954 G→C位點(diǎn)基因多態(tài)性與非洲坦桑尼亞和肯尼亞兒童瘧疾患者的嚴(yán)重程度相關(guān)，認(rèn)為C等位基因?qū)е翹OS2啟動(dòng)子功能活性增強(qiáng)，產(chǎn)生大量NO，對(duì)瘧疾具有殺傷作用。Hobbs等[7]也有類似報(bào)導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者和正常對(duì)照組NOS2-954G→C多態(tài)性分布有顯著差異。白癜風(fēng)患者中C等位基因的頻率高于正常對(duì)照組，C等位基因的出現(xiàn)可能會(huì)增加白癜風(fēng)的易感性。進(jìn)一步分析NOS2-954位點(diǎn)基因型分布與白癜風(fēng)患者臨床資料相關(guān)性表明，GC及CC基因型可能是兒童期發(fā)病、尋常型、穩(wěn)定期、不伴有自身免疫病白癜風(fēng)患者的易感因素。

本研究首次應(yīng)用PCR-RELP方法研究發(fā)現(xiàn)NOS2-954 G→ C位點(diǎn)基因多態(tài)性與白癜風(fēng)有非常密切的關(guān)系，但目前NO及其合酶在白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的作用及其機(jī)制尚不完全清楚，NOS2基因多態(tài)性與白癜風(fēng)的可能相關(guān)性及作用機(jī)制亦有待更深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Ortonne J-PBose SK. Vitiligo: where do we stand[J]? Pigment Cell Res， 1993，6:61-72.

[2]Boissy RE， Nordlund JJ. Biology of vitiligo. In: Arndt KA， LeBoit PE， Robinson JK， Wintroub BU， eds. Cutaneous Medicine and Surgery: An Integrated Program in Dermatology[M]. Philadelphia: WB Saunders Company，1995，1210-1218.

[3]Le Poole C， Boissy RE. Vitiligo. In: Arndt KA， Le Boit PE， Robinson JK， Wintroub BU， eds. Semin Cutan Med Surg[M]. Vol. 16. Philadelphia: WB Saunders Company，1997:3-14.

[4]Vladim'1r Holáˇn， Magdaléna Krulová， Alena Zaj'1cová.Nitric oxide as a regulatory and effector molecule in the immune system[J]. Molecular Immunology2001，38 :989-995.

[5]M.-M. Cals-Grierson， A.D. Ormerod. Nitric oxide function in the skin[J]. Nitric Oxide，2004，10 :179-193.

[6]Kun JF，Mordmuller B，Perkins DJ，et a1．Nitric oxide synthase 2(Lambarene)(G-954C)increased nitric oxide production，and protection against malaria[J]．J Infect Dis，2001；184(3)：330-336．

[7]Hobbs MR，Udhayakumar V，Levesque MC，et a1．A new NOb2 promoter polym orphism aasoc iated with increased nitric oxide production and protection from severe malaria in Tanzanian and Kenyan children[J]．Lancet，2002，360(9344)：1468-1475．

[8]中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組白癜風(fēng)的臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)[J].中華皮膚科雜志，2004，37(7):440．

[9]Singh VK，Mehmtra S，Narayan P，et a1.Modulation of autoimmune diseases by nitric oxide[J].Immunol Res，2000，22(1):l-l9.

[10]Roc ha IM，Guillo LA．Lipopolysaccharide and cytokines induce nitric oxide synthase and produce nitric oxide in cultured nolTaal human melgnocytes[J]．Arch Dermatol Res，200l，293(5)：245-248.

[11]Ivanova K， Poole IC， Gerzer R，et a1．Effect 0f nitric oxide on the adhesion of human melanocytes to extracellular matrix components[J]．J Pathol，l997，183(4)：469-476.

[12]Kolb H，Kolb-Bachofen V．Nitric oxide：a pathogenetic factor in auto-immunity[J].Immunol ay，1992，13(5)：157-l60.

[收稿日期]2008-05-25[修回日期]2008-08-15

編輯/張惠娟