摘要：試驗(yàn)的菌種是從寧夏固原山區(qū)完全自然生長(zhǎng)的土種健康產(chǎn)蛋母雞的大腸和盲腸中分離獲得的，共分離出44株菌株。通過(guò)對(duì)這44株菌株的菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色鏡檢，篩選出12株進(jìn)行了乳球菌屬的生理生化鑒定，初步確定12株菌株屬于乳球菌屬(Lactococcus)。通過(guò)糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸鑒定，確定8株為植物乳球菌(L.plantarum)，4株為棉籽糖乳球菌(L.roffinolactis)。各項(xiàng)鑒定結(jié)果均符合乳球菌屬和相應(yīng)種鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：乳球菌；生理生化鑒定；微生態(tài)制劑；益生菌

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

利用無(wú)毒害、兼性厭氧的乳桿菌(Lactobacillus)配合其他益生菌(Probiotics)制成的動(dòng)物微生態(tài)制劑(Animal Micro-ecological Agent，AMEA)，替代抗生素預(yù)防和治療動(dòng)物的消化道疾病有過(guò)一些報(bào)道。但是，目前制做動(dòng)物微生態(tài)制劑的益生菌種大多來(lái)自人或哺乳動(dòng)物腸道，或來(lái)自土壤，而從完全自然生長(zhǎng)的健康土種雞腸道中分離正常菌群的還很少。本次試驗(yàn)的目的是從自然生長(zhǎng)的健康土種雞的腸道中篩選出可以配制微生態(tài)制劑的乳球菌，再配合從雞腸道中分離的其他乳酸菌(乳桿菌、腸球菌)和無(wú)毒害的芽孢桿菌(需氧)，制做成更易于在雞的腸道中定植存活的動(dòng)物微生態(tài)制劑。

1 材料

1.1 菌種來(lái)源

試驗(yàn)菌種取自寧夏固原山區(qū)完全自然生長(zhǎng)的土種健康產(chǎn)蛋母雞的大腸和盲腸。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為普通乳酸菌培養(yǎng)基和El-liker培養(yǎng)基。

1.3 生理生化鑒定培養(yǎng)基

試驗(yàn)生理生化鑒定培養(yǎng)基為運(yùn)動(dòng)性、接觸酶、厭氧生長(zhǎng)、45℃生長(zhǎng)、NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5％生長(zhǎng)、pH9.6生長(zhǎng)、糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸等生理生化鑒定培養(yǎng)基。

1.4 染色試劑

試驗(yàn)使用的染色劑均為革蘭氏染色試劑。

1.5 生理生化鑒定試劑

試驗(yàn)采用的生理生化鑒定試劑為運(yùn)動(dòng)性、接觸酶、NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5％生長(zhǎng)、pH9.6生長(zhǎng)、糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸等生理生化鑒定試劑。

1.6 發(fā)酵產(chǎn)酸中使用的糖醇

試驗(yàn)發(fā)酵產(chǎn)酸中使用的糖醇為半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、松三糖和棉籽糖。

2 試驗(yàn)方法

2.1 增菌培養(yǎng)

將雞屠宰后，分別從大腸和盲腸靠近黏膜處無(wú)菌地取少許內(nèi)容物，并刮取少許黏膜黏液，接種于液態(tài)普通乳酸菌培養(yǎng)基中，進(jìn)行厭氧增菌培養(yǎng)。

2.2 分離純化

用增菌培養(yǎng)后的菌液在Elliker瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，從中選取各個(gè)形態(tài)不同的菌落再進(jìn)行劃線分離和純化培養(yǎng)，將分離純化的菌落接種于液態(tài)Elliker培養(yǎng)基中和Elliker瓊脂培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)24～48 h后，保存于4℃冰箱中等待進(jìn)一步鑒定。

2.3 菌落形態(tài)特征觀察

將分離純化的菌株分別接種于Elliker瓊脂培養(yǎng)基平板和斜面上，厭氧培養(yǎng)48～72 h后，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并描述各菌株的菌落形態(tài)特征。

2.4 細(xì)菌革蘭氏染色觀察

選取培養(yǎng)48～72h的菌落涂片，做革蘭氏染色和油鏡觀察。

2.5 生理生化鑒定

按乳球菌屬(Lactococcus)和種的生理生化鑒定試驗(yàn)要求進(jìn)行鑒定，分別進(jìn)行了運(yùn)動(dòng)性、接觸酶、厭氧生長(zhǎng)、45℃生長(zhǎng)、NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5％耐鹽生長(zhǎng)、pH9.6堿性環(huán)境生長(zhǎng)、糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸(葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、松三糖、甘露醇)等生理生化鑒定。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌落形態(tài)特征

試驗(yàn)通過(guò)分離純化，共獲得44株菌株，經(jīng)鑒定確認(rèn)共有12株菌株為乳球菌屬的細(xì)菌，這12株菌株依次命名為NXB201，NXB202，NXB203，NXB204，NXB205，NXB206，NXB207，NXB208，NXB209，NXB210，NXB211和NXB212菌株。各菌落形態(tài)特征描述見(jiàn)表1。

3.2 革蘭氏染色觀察

試驗(yàn)中，首先對(duì)所有44株菌株進(jìn)行了革蘭氏染色的油鏡觀察，從中篩選出12個(gè)菌株，均為革蘭氏染色陽(yáng)性球菌，細(xì)菌菌體形態(tài)為球形或卵圓形，NXB201菌株的細(xì)菌排列形態(tài)為單個(gè)分布和短鏈狀排列。NXB202，NXB203，NXB204，NXB205，NXB207，NXB210和NXB211菌株的細(xì)菌排列形態(tài)為成對(duì)排列和短鏈狀排列。NXB208和NXB209菌株的細(xì)菌排列形態(tài)為成對(duì)排列。NXB206和NXB212菌株的細(xì)菌排列形態(tài)為單個(gè)分布和成對(duì)排列，排列結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 生理生化鑒定

生理生化鑒定分2步進(jìn)行，首先根據(jù)乳球菌屬的鑒別特征進(jìn)行鑒定，確定這12個(gè)菌株是否屬于乳球菌屬，然后再根據(jù)乳球菌屬內(nèi)種間的鑒別特征進(jìn)行鑒定，確定這12個(gè)菌株分別是哪個(gè)乳球菌種。

3.3.1 乳球菌屬的鑒別特征 由表2可見(jiàn)，試驗(yàn)篩選出的12個(gè)菌株從細(xì)菌菌體形態(tài)到pH9.6生長(zhǎng)等10個(gè)鑒定指標(biāo)均符合乳球菌屬的鑒別特征，可以確認(rèn)這12個(gè)菌株屬于乳球菌屬。

3.3.2 乳球菌屬內(nèi)種間的鑒別特征——糖醇類發(fā)酵 乳球菌屬內(nèi)種的鑒定主要是進(jìn)行糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)，在本次試驗(yàn)中共應(yīng)用了7種糖醇，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。NXB202，NXB203，NXB204，NXB205和NXB207菌株的所有7種糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸的鑒定結(jié)果符合植物乳球菌(L.plantarum)的鑒別特征，NXB201，NXB206和NXB208菌株有6種糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸的鑒定結(jié)果符合植物乳球菌的鑒別特征，僅半乳糖不完全相符，可以確定這8株乳球菌菌株為植物乳球菌。NXB209，NXB210和NXB211菌株的所有7種糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸的鑒定結(jié)果符合棉籽糖乳球菌(L.raffinolactis)的鑒別特征，NXB212菌株有6種糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸的鑒定結(jié)果符合棉籽糖乳球菌的鑒別特征，僅乳糖不完全相符，可以確定NXB209，NXB210，NXB211和NXB212菌株為棉籽糖乳球菌。

4 討論

本試驗(yàn)共分離得到12株乳球菌，分屬于2個(gè)乳球菌種，這12株乳球菌的生理生化鑒定結(jié)果基本符合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《乳酸菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》等文獻(xiàn)中乳球菌屬和相應(yīng)種的相關(guān)描述。根據(jù)鑒定結(jié)果，基本可以確定NXB201，NXB202，NXB203，NXB204，NXB205，NXB206，NXB207和NXB208菌株為植物乳球菌。NXB209，NXB210，NXB211和NXB212菌株為棉籽糖乳球菌。根據(jù)表2中細(xì)菌菌體形態(tài)、細(xì)菌排列形態(tài)和生理生化鑒定的結(jié)果，可以確定在本次試驗(yàn)中分離獲得的8株植物乳球菌分別是3個(gè)不同的菌株，NXB201和NXB206菌株屬同1株植物乳球菌菌株，NXB202，NXB203，NXB204，NXB205和NXB207菌株屬同1株植物乳球菌菌株，NXB208菌株則是另1株植物乳球菌菌株?？梢源_定試驗(yàn)中分離獲得的4株棉籽糖乳球菌分別是2個(gè)不同的菌株，NXB209，NXB210和NXB211菌株屬同1株棉籽糖乳球菌菌株，NXB212菌株則是另1株棉籽糖乳球菌菌株。根據(jù)文獻(xiàn)資料報(bào)道，這2個(gè)乳球菌種都可以應(yīng)用于動(dòng)物微生態(tài)制劑中，其中植物乳球菌是優(yōu)選菌種。

可以在微生態(tài)制劑中應(yīng)用的益生菌基本可分為3大類：①需氧的芽孢桿菌可以作為益生菌應(yīng)用的主要有枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌等。②兼性厭氧的乳桿菌、腸球菌和乳球菌等乳酸細(xì)菌。③厭氧的擬桿菌。乳酸菌能夠分解糖類以產(chǎn)生乳酸，乳酸為其主要代謝產(chǎn)物。乳球菌是乳酸細(xì)菌中的一類，乳球菌雖然不像乳桿菌那樣在家禽的腸道內(nèi)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但在維持消化道的正常微生物群系的穩(wěn)定方面起著非常重要的作用。乳球菌也能夠像乳桿菌一樣分解糖類產(chǎn)生乳酸，生長(zhǎng)于厭氧或兼性厭氧環(huán)境中，在pH3.0～4.5的酸性條件下生存。乳球菌協(xié)同乳桿菌在動(dòng)物腸道中將單糖，特別是乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，從而降低腸道的pH值，防止外來(lái)菌在腸道中定植，抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等病原菌的生長(zhǎng)，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道的pH值，激活胃蛋白酶，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，幫助食物的消化和吸收，減輕脹氣，促進(jìn)肝臟功能等，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排斥作用(競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn))抑制病原菌的生長(zhǎng)。乳球菌配合芽孢桿菌和其他乳酸細(xì)菌(乳桿菌和腸球菌)以及厭氧的擬桿菌制成動(dòng)物微生態(tài)制劑，可有效地抑制消化道中的致病菌繁殖，改善消化道的微環(huán)境，代替抗生素預(yù)防和治療畜禽消化道疾病，同時(shí)還可以克服抗生素的各種弊端，如抗藥性、二重感染及抗生素殘留等。

在本次試驗(yàn)中分離獲得的植物乳球菌和棉籽糖乳球菌作為益生菌種，在動(dòng)物微生態(tài)制劑中的應(yīng)用效果如何，還需進(jìn)一步做動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)才能確定。

責(zé)任編輯、校對(duì) 武曉蘭