黃世文　高成偉　王　玲　王全永

摘要：結(jié)合他人經(jīng)驗(yàn)和近年作者的實(shí)際工作，本文系統(tǒng)介紹了土壤標(biāo)本的采集、處理，放線菌的分離、純化。放線菌分離物及其代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌(真菌、細(xì)菌)、害蟲(chóng)和雜草的生物測(cè)定、評(píng)價(jià)，為研發(fā)微生物農(nóng)藥打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：土壤標(biāo)本；放線菌；分離；生物測(cè)定

中圖分類號(hào)：Q 939．132

放線菌是產(chǎn)生抗生素活性物質(zhì)最大的、具有很大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一類原核微生物。迄今，在工業(yè)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)上都有許多利用抗生素的成功實(shí)例。我國(guó)自20世紀(jì)50年代就開(kāi)始研究利用抗生素，在農(nóng)業(yè)上主要是防治各種作物的病蟲(chóng)害，如5406防治土傳病害，推廣面積曾達(dá)667萬(wàn)hm²以上；井岡霉素防治水稻、麥類紋枯病、菌核病等，每年應(yīng)用面積1 333萬(wàn)hm²以上，自投放市場(chǎng)以來(lái)已30多年，一直對(duì)紋枯病高效，未發(fā)現(xiàn)抗藥性。阿維菌素自20世紀(jì)90年代投放國(guó)內(nèi)市場(chǎng)以來(lái)，已逐步成為繼Bt制劑、井岡霉素之后生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的支柱產(chǎn)品，為我國(guó)生物農(nóng)藥市場(chǎng)贏得了巨大商機(jī)。國(guó)內(nèi)至今已完成登記阿維菌素產(chǎn)品80多個(gè)，是明確最具發(fā)展?jié)摿Φ纳镛r(nóng)藥之一。放線菌及其產(chǎn)生的抗生素的研究、開(kāi)發(fā)與應(yīng)用取得了巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。

放線菌大量存在于土壤中，從土壤中分離、純化、快速篩選目標(biāo)放線菌是抗生素開(kāi)發(fā)、應(yīng)用的基礎(chǔ)。下面結(jié)合他人經(jīng)驗(yàn)和作者近年的實(shí)際工作，從土壤采集、處理、菌株分離、純化，放線菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌、害蟲(chóng)、雜草等的生物測(cè)定等方面作一介紹。

1放線菌的分離

1．1土壤標(biāo)本的采集

放線菌屬好氣性微生物，主要生活在較干燥、透氣性好、中性到微堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中，特別是在我國(guó)南方熱帶及亞熱帶地區(qū)肥沃的土壤中，防線菌種類豐富。采集土壤標(biāo)樣時(shí)，應(yīng)根據(jù)放線菌的生活特性，有針對(duì)性地進(jìn)行采樣。宜選擇菜地、茶園、果園等地采樣。選定采樣地點(diǎn)后，先鏟去表層土，挖取5～30 cm深的土壤數(shù)十克，裝入牛皮紙信封，封好袋口；潮濕的土壤宜裝入塑料袋或鋁盒內(nèi)，做好編號(hào)記錄，帶回實(shí)驗(yàn)室供分離用。

采回的土壤標(biāo)本一般宜及時(shí)進(jìn)行分離，如不能做到隨采隨分，宜將土壤放在陰涼、通風(fēng)干燥處，使其風(fēng)干，保藏備用，但保藏時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

放線菌的分離方法很多，這里主要介紹分離普通放線菌的彈土法和稀釋畫(huà)線法。

1．2放線菌的彈土分離法

1．2．1分離培養(yǎng)基

分離放線菌常用的培養(yǎng)基主要有：

a．高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉2.0％、K₂HPO₄0.05％、NaCl 0.05％、KNO₃0.1％、MgSO₄·7HO₂0.05％、FeSO₄0.001％、瓊脂1.5％～2.0％、pH 7.2～7.4、在121℃(15磅)高溫高壓滅菌20 min。

b．葡萄糖——天門(mén)冬素瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖1.0％、天門(mén)冬素0.05％、牛肉膏0.2％、K₂HPP₄0.05％、瓊脂2.0％、pH6.8或自然、8磅滅菌30 min。

c．精氨酸一甘油瓊脂培養(yǎng)基：精氨酸0.1％、甘油1.25％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄·7H₂0 0.05％、NaCl0.1％、ZnSO₄·7H₂O0.000 1％、CuSO₄·5H₂O0.000 1％、Fe₂(SO₄)₃·6H₂O0.001％、MnSO₄·H₂O0.000 1％、瓊脂2.0％，pH 9.0，8磅滅菌30 min。

1．2．2平板培養(yǎng)基制備

根據(jù)分離量多少，準(zhǔn)備好消毒高氏一號(hào)培養(yǎng)基500 mL或1 000 mL，滅菌的7 cm或9 cm直徑培養(yǎng)皿中倒入10～20 mL培養(yǎng)基，制成平板備用。

1．2．3土壤準(zhǔn)備與接種

將土壤用研缽研細(xì)，60目過(guò)篩，取一定量細(xì)土平鋪于滅過(guò)菌的光滑硬紙板上，紙面積略大于培養(yǎng)皿的口徑，將多余的土輕輕傾去，見(jiàn)紙板上有一層細(xì)土粒粘附著則較為理想。接種時(shí)將倒好培養(yǎng)基的皿蓋微微揭開(kāi)，將土壤紙板粘土面向下輕輕插入覆蓋其上，用皿蓋微微觸動(dòng)一下紙板并立刻抽出，蓋好皿蓋即接種完畢。取下的土壤紙板，還可用于第2、第3及第4套分離培養(yǎng)皿接種。用于第2套接種時(shí)，輕輕彈動(dòng)一下紙板；用于第3、第4套皿接種時(shí)，可在紙板背面稍加重彈力，使粘附于紙板上殘留的少量土粒落下，達(dá)到控制理想的出菌率。

如果要分離罕見(jiàn)的放線菌，如小單孢菌、小雙孢菌．游動(dòng)放線菌或嗜熱放線菌等，則可將土壤研細(xì)后作干熱處理(120℃下處理1 h)。這樣在分離時(shí)可以大大降低細(xì)菌、霉菌和鏈霉菌的數(shù)量，使罕見(jiàn)的放線菌出現(xiàn)的比率提高。

1．3稀釋分離法

此法的準(zhǔn)備工作與彈土法相同，但稀釋比應(yīng)根據(jù)土壤中放線菌數(shù)量的多寡來(lái)決定。因此，往往在正式分離前需做一次預(yù)備分離試驗(yàn)，找出適當(dāng)?shù)南♂尡?。通過(guò)預(yù)備分離試驗(yàn)，可以觀察到不同的土壤中放線菌、細(xì)菌和霉菌的數(shù)量關(guān)系，啟示在分離工作中應(yīng)采取何種對(duì)策。若土壤中細(xì)菌和霉菌過(guò)多時(shí)，可考慮在分離培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抑菌劑。如抑制霉菌可加制霉菌素(50單位／mL)或多菌靈(30單位／mL)抑制細(xì)菌可加鏈霉素(25～50單位／mL)等。

稱取研細(xì)的土壤5 g，加入盛有45 mL滅菌水的三角瓶中，充分振蕩，制成10^-1土壤濃度懸浮液。待土粒沉淀后，吸取1.0 mL上清液，移入盛有9 mL滅菌水的試管中，制成10^-2土壤濃度懸浮液。依此類推，制成10^-3、10^-4和10^-5土壤濃度懸浮液，從土壤中分離放線菌多采用10^-3～10^-5土壤濃度。通常吸取上述3種濃度懸浮液0.1 mL(約2滴)，加到分離培養(yǎng)基平板上，用滅菌涂布棒涂均。

1．4放線菌培養(yǎng)、挑菌和純化

將上述接種好的培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。若分離嗜熱放線菌，則應(yīng)放在45～50℃下培養(yǎng)。3～4 d后即可長(zhǎng)出放線菌單菌落。

在分離放線菌之前，必須學(xué)習(xí)、了解放線菌的形態(tài)特征、顏色等。初次分離，如果沒(méi)有固定目標(biāo)菌類，應(yīng)將所有的放線菌單菌落都及時(shí)轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)瓊脂或葡萄糖一天門(mén)冬素瓊脂斜面上，進(jìn)行純化

培養(yǎng)。一般鏈霉菌的菌落大，氣生菌絲豐茂，色澤多種多樣；而小單孢菌、諾卡氏菌、游動(dòng)放線菌等菌落小，光禿無(wú)氣生菌絲，色澤鮮艷。應(yīng)注意選留后幾類放線菌，在教學(xué)上可豐富分類學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，同時(shí)也可為篩選新抗生素或酶制劑等提供菌源。

如果細(xì)菌、霉菌干擾不嚴(yán)重時(shí)，可延長(zhǎng)分離平板的培養(yǎng)時(shí)間，讓一些生長(zhǎng)速度慢的放線菌陸續(xù)地生長(zhǎng)出來(lái)，分批挑菌。一般純化培養(yǎng)7～14 d，待生長(zhǎng)成熟后終止培養(yǎng)，編號(hào)登記，備用。

2放線菌的生物測(cè)定

經(jīng)純化培養(yǎng)的放線菌有否生產(chǎn)實(shí)用價(jià)值，即其代謝產(chǎn)物是否對(duì)有害生物(在農(nóng)業(yè)上主要指病蟲(chóng)草)有毒性，需要通過(guò)生物測(cè)定來(lái)確定。放線菌的生物測(cè)定，不同的對(duì)象測(cè)定方法不同，一般是用放線菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。下面將從放線菌發(fā)酵培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物的提取、對(duì)病原菌、害蟲(chóng)和雜草的生物測(cè)定等方面作一介紹。

2．1放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)基

(1)日本培養(yǎng)基：2.5％葡萄糖、1.0％大豆粉、0.4％KC1、0.25％酵母提取汁、0.1％牛肉膏、0.5％(NH₄)₂SO₄、0.02％K₂HPO₄、0.3％CaCO₃(消毒前pH調(diào)至7.2)。(2)中國(guó)農(nóng)大培養(yǎng)基：2％淀粉、0.1％KNO₃、0.066％K₂HPO₄·7H₂O、0.05％Mg-SO₄·7H₂O、0.05％NaCl、0.001％FeSO₄、pH7.2。

2．2發(fā)酵培養(yǎng)及離心上清液的提取

250 mL三角瓶中每瓶裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，高溫高壓消毒20 min，冷卻備用。每瓶中接入培養(yǎng)7 d的放線菌菌塊(d=0.9 mm)2～4塊。在28～30℃恒溫?fù)u床上以120～150 r／min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液在離心機(jī)上以1 500 r／min離心10 min，取上清液裝入消毒瓶中，加少許防腐劑保存?zhèn)錅y(cè)。沉淀物(菌絲團(tuán))裝另一消毒瓶，加等體積分析純丙酮浸提24 h，以同樣方法離心，取上清液，備測(cè)。

2．3放線菌發(fā)酵液對(duì)有害生物的生物測(cè)定

2．3．1發(fā)酵液對(duì)病原菌的毒性測(cè)定

2．3．1．1對(duì)真菌的生物測(cè)定

一般是將放線菌發(fā)酵上清液與被測(cè)菌的培養(yǎng)基混合，配成不同濃度的發(fā)酵液培養(yǎng)基，倒入直徑9 cm消毒培養(yǎng)皿，制成平板，同時(shí)以空白發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液和無(wú)菌水代替發(fā)酵上清液，與被測(cè)菌培養(yǎng)基混合作為對(duì)照。將生長(zhǎng)一致的7 d菌齡被測(cè)菌菌塊(d=0.6～0.8 cm)接入平板中央；也可取0.1 mL放線菌發(fā)酵液培養(yǎng)基平板上，用消毒三角玻棒涂布均勻，直接將被測(cè)病原菌塊接入平板中央，有菌一面朝下。接種后置恒溫培養(yǎng)箱(溫度視不同的菌而定，一般多為28℃)培養(yǎng)，每隔1天按十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并觀察菌落顏色、生長(zhǎng)情況，菌核有無(wú)生成等，直到對(duì)照菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿為止。

2．3．1．2對(duì)細(xì)菌的生物測(cè)定

細(xì)菌與真菌有所不同，一般是將被測(cè)細(xì)菌與該菌的培養(yǎng)基混合，充分搖勻，制成含細(xì)菌培養(yǎng)基平板。用0.7 cm直徑的打孔器將定性濾紙打孔，圓紙片消毒后備用。將放線菌發(fā)酵離心上清液配成不同濃度，同樣以空白發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液和無(wú)菌水為對(duì)照。圓紙片蘸發(fā)酵離心上清液或?qū)φ找海埰浞纸?，放入時(shí)不滴液為宜，放人含細(xì)菌培養(yǎng)基平板中央。置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中宜保持較高的濕度(RH＞85％)，以免“藥紙片”很快干燥，影響藥效。每隔1天按十字交叉法測(cè)量1次抑菌直徑，并觀察抑菌圈的清晰度，一般至少測(cè)量5次。

最后通過(guò)計(jì)算真菌菌落大小和對(duì)細(xì)菌的抑菌圈大小來(lái)評(píng)價(jià)放線菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的毒性。真菌菌落越小，細(xì)菌抑菌圈越大，說(shuō)明放線菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物毒性強(qiáng)，反之則相反。

一般的，由于對(duì)分離到的放線菌到底哪種類型菌對(duì)病原菌有效，哪種菌無(wú)效，心中無(wú)底，而且初分離到的菌種數(shù)量較多。為減少發(fā)酵、離心等的工作量和費(fèi)用，對(duì)初次分離到的菌株最好采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行初步測(cè)定。只有那些經(jīng)初步測(cè)定，對(duì)病原菌具有較強(qiáng)抑制活性的菌株才進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)、離心提取上清液作測(cè)定。當(dāng)然有些放線菌可能對(duì)峙培養(yǎng)效果好，而發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)毒差，有些菌則相反，造成誤選或淘汰一些有潛力的菌株。

2．3．2發(fā)酵液對(duì)害蟲(chóng)毒性的測(cè)定

放線菌發(fā)酵液對(duì)害蟲(chóng)的毒性測(cè)定可分為觸殺和胃毒作用進(jìn)行。

2．3．2．1胃毒作用測(cè)定

方法1：將發(fā)酵液配成不同濃度藥液，將供試害蟲(chóng)喜食的寄主植物葉或莖在藥液中浸30～60 s(視植物類型而定，表面蠟質(zhì)多的植物浸的時(shí)間要長(zhǎng)些)，使表面濡濕，懸掛晾干不滴液，置入大培養(yǎng)皿或大試管，放入供試蟲(chóng)，每皿5～10頭(條)(視蟲(chóng)量和培養(yǎng)皿及試管大小而定)，蓋上皿蓋或一層紗市封口。每處理重復(fù)3次，每隔一定時(shí)間觀察、描述試蟲(chóng)的活動(dòng)、取食情況，記錄死蟲(chóng)數(shù)。

方法2：對(duì)于蠶、菜青蟲(chóng)或小菜蛾等食葉昆蟲(chóng)的測(cè)定，可采用以下方法：將2片供試蟲(chóng)寄主植物葉片正面涂藥，將涂藥葉面相對(duì)疊合，并用大頭針嚴(yán)密訂緊，將葉邊緣修剪整齊，以免蟲(chóng)子接觸藥液，使蟲(chóng)子只能通過(guò)取食才能接觸藥液，每隔一定時(shí)間觀察、描述試蟲(chóng)的活動(dòng)、取食情況，記錄死蟲(chóng)數(shù)。

2．3．2．2觸殺作用測(cè)定

方法1：將供試蟲(chóng)不取食的作物葉片正面、或塑料片用不同濃度的發(fā)酵液涂布，待藥液干后，將供試蟲(chóng)放在上面，讓其爬行，但不取食，幾分鐘后移入寄主葉片上，讓其取食，正常飼養(yǎng)，每隔一定時(shí)間觀察、描述試蟲(chóng)的活動(dòng)、取食情況，記錄死蟲(chóng)數(shù)。

方法2：供試蟲(chóng)飼養(yǎng)在寄主植物上，用喉頭噴霧器將不同濃度的發(fā)酵液直接噴霧在試蟲(chóng)體表，每隔一定時(shí)間觀察、描述試蟲(chóng)的活動(dòng)、取食情況，記錄死蟲(chóng)數(shù)。上述試驗(yàn)均需設(shè)空白發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液和無(wú)菌水作對(duì)照，如能增設(shè)一個(gè)供試蟲(chóng)常用防治藥劑作對(duì)照則更好。

2．3．3發(fā)酵液對(duì)雜草毒性的測(cè)定

將待測(cè)雜草種子用溫水預(yù)浸24～48 h(視不同雜草種而定)備用。將放線菌發(fā)酵離心上清液配成不同稀釋濃度，設(shè)空白發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液和無(wú)菌水為對(duì)照。

2．3．3．1測(cè)定發(fā)酵液對(duì)雜草種子發(fā)芽率的影響

挑10粒飽滿一致、預(yù)浸過(guò)的雜草種子放入不同濃度發(fā)酵離心液中浸24 h，撈出后分別置于用相同發(fā)酵液濃度浸過(guò)的吸水紙或?yàn)V紙上，放人培養(yǎng)皿，蓋上蓋，在30～35℃下催芽，每隔1天記錄種子的發(fā)芽情況，觀察芽的生長(zhǎng)狀況，并作描述。觀察3～4次(6～8 d)，每處理最少重復(fù)3次，最終統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

2．3．3．2測(cè)定發(fā)酵液對(duì)雜蘋(píng)根、芽生長(zhǎng)的影響

將預(yù)浸過(guò)的雜草種子在30～35℃下催芽至露白，挑10粒芽長(zhǎng)及生長(zhǎng)基本一致的種子放入不同濃度發(fā)酵離心液中，在30℃恒溫下培養(yǎng)，分別在3 d和6 d天測(cè)量雜草根、芽長(zhǎng)，同時(shí)觀察根、芽生長(zhǎng)情況，如生長(zhǎng)是否健壯，有無(wú)須根，顏色是否正常，并作描述。

所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，即可初步判斷某一放線菌是否具有開(kāi)發(fā)、應(yīng)用價(jià)值，是否值得進(jìn)一步研究。