李　偉　鄭肖蘭　賀春萍　吳偉懷　李　銳　鄭服叢

摘要：本研究基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，建立了芒果膠孢炭疽菌高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得一批炭疽菌的T-DNA插入突變體，其目的是為炭疽菌的功能基因組學(xué)研究和致病相關(guān)基因的克隆奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下：通過摸索并優(yōu)化了體系的各項因子，在潮霉素篩選濃度為200 μg／mL，苗液濃度為OD₆₆₀=0.15條件下，AS為200 μmol/L，選擇pH5.5的IM共培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化效果最好；進一步通過對轉(zhuǎn)化子的繼代穩(wěn)定性和PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)潮霉素抗性穩(wěn)定遺傳和假陽性率低；通過菌落形態(tài)觀察和產(chǎn)孢能力的測定獲得3個菌落形態(tài)異常突變體，6個產(chǎn)孢能力下降突變體。

關(guān)鍵詞：膠孢炭疽菌；遺傳轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌介導(dǎo)插入；突變

中圖分類號：Q 78

芒果具有“熱帶果王”之美稱，在熱帶、亞熱帶地區(qū)出口水果中占有重要的地位。芒果膠孢炭疽菌[Colletotrichum hloeosporioides(Penz.)Penz.&sacc.以下簡略為CG]，是芒果的主要病原菌，引起炭疽病，危害芒果的果實、葉片、花穗等器官。造成落葉、落花、落果、嫩枝枯死以及采后果實腐爛等，導(dǎo)致嚴重的經(jīng)濟損失，其中以果實危害損失最為嚴重。炭疽菌不僅潛伏侵染芒果幼果，而且還可以在采后的貯藏、運輸過程中，果實后熟時開始發(fā)病，造成：趕批爛果。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1菌種、質(zhì)粒及其來源

芒果膠孢炭疽菌(CG)：由本實驗室分離自湛江，?？诤唾僦菥哂械湫吞烤也“Y狀的芒果果實病斑。獲得的菌株經(jīng)純化和單孢分離后保存于PDA斜i面。用于本研究中進行遺傳轉(zhuǎn)化試驗的是致病力和產(chǎn)孢能力都較強的儋州菌株LCG5。農(nóng)桿菌菌株：AGL-1(含質(zhì)粒pBHt2)。

1．1．2主要培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、YEP培養(yǎng)基、MM液體培養(yǎng)基、IM液體培養(yǎng)基、MMRK液體培養(yǎng)基。

1．2 CG遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

1．2．1供試菌株的篩選

1．2．1．1CG的致病力測定

首先將CG在28℃恒溫下培養(yǎng)7 d。接著取新鮮無病菌的芒果，在芒果表面均勻選取5個點，用燒過的針扎出大小一致的傷口，用打孔器打出直徑為0.5 cm的菌塊，菌面緊貼傷口，無菌水浸泡的濕棉花，覆蓋在菌塊上保濕。每個菌株作3個重復(fù)，3 d后記錄發(fā)病情況。發(fā)病分級標(biāo)準(zhǔn)為0級：刺傷點不發(fā)??；1級：刺傷點發(fā)病并連成片，病斑直徑小于1 cm；2級：病斑直徑1～2 cm；3級：病斑直徑2～3 cm；4級：病斑直徑3～4 cm；5級：病斑直徑大于4 cm。

1．2．1．2CG的產(chǎn)孢能力測定

取大小相同(直徑為5 mm)、培養(yǎng)時間一致(7 d)的各菌株菌絲塊，移于平板上，28℃、黑暗條件下培養(yǎng)7 d。用10 mL滅菌水洗下各培養(yǎng)皿分生孢子，旋渦混勻，定容至相同體積，然后用血球計數(shù)板進行孢子計數(shù)。每一菌株計3個培養(yǎng)皿，重復(fù)2次，取平均值。

1．2．2抑制LCG5的潮霉素最佳濃度的篩選

先將培養(yǎng)7 d的LCG5，刮去表面的菌絲，用挑針挑取少量的孢子堆，點接到含潮霉素濃度0、100、120、140、160和200 μg／mL的固體MM平板上。然后置于28℃恒溫箱中進行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24、44、48、72 h觀察記錄。

1．2．3最佳共培條件的篩選

1．2．3．1不同pH共培養(yǎng)基IM的準(zhǔn)備

用1 mol／L HCl和1 mol／L NaOH調(diào)節(jié)IM液體和固體培養(yǎng)基，pH計標(biāo)定培養(yǎng)基的pH為5.0、5.5、6.0，4℃冰箱內(nèi)保存。

1．2．3．2不同濃度農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

取4℃冰箱內(nèi)保存的農(nóng)桿菌，吸取100μL，加到5 mL MMRK選擇培養(yǎng)基中，200 r／min，28℃搖菌2 d。將農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD₆₆₀為0.75，然后用MMRK液體培養(yǎng)基分別稀釋1、5、10、15、20×。接著4 000 r／min離心收集農(nóng)桿菌，在無菌操作臺上倒掉MM，用相同體積的IM液體培養(yǎng)基重懸。

1．2．3．3AS對轉(zhuǎn)化效率的影響

取已活化的農(nóng)桿菌AGL-15X菌液，4 000 r／min離心5 min，pH5.5的IM液體培養(yǎng)基重懸，重復(fù)共培養(yǎng)步驟，設(shè)不加AS的為空白對照。

1．3抗性菌株的篩選

1．3．1篩選培養(yǎng)及抗性穩(wěn)定測定

將于MM固體培養(yǎng)基(潮霉素：200μg／mL)培養(yǎng)的抗性菌落，轉(zhuǎn)接到含有200 μg／mL潮霉素的固體PDA上，并設(shè)LCG5作對照，于28℃恒溫培養(yǎng)，進行初篩；7 d后，有孢子產(chǎn)生的炭疽菌進行單孢分離。分離的單孢轉(zhuǎn)接到固體PDA(潮霉素：200 μg／mL)上進行二次篩選；沒有孢子產(chǎn)生的炭疽菌，在菌落邊緣挑取單根菌絲末端進行分離培養(yǎng)，3 d后再次篩選培養(yǎng)。以上步驟中經(jīng)二次篩選的抗性菌株，轉(zhuǎn)接到含有200 μg／mL潮霉素PDA上重復(fù)篩選。

1．3．2TCG(遺傳轉(zhuǎn)化體)的PCR檢測

1．3．2．1TCG總DNA提取及農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒DNA的堿法小量提取

提取步驟參照《植物基因工程原理與技術(shù)》。

1．3．2．2轉(zhuǎn)化菌株的PCR檢測

引物設(shè)計：根據(jù)質(zhì)粒PBHt2中潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因編碼區(qū)設(shè)計了一對引物：Hf：5-TGCGC-CCAAGCTGCATCAT-3；Hr：5-TGAACTCAC-cGCGACGTCTGT-3；PCR反應(yīng)體系：10×反應(yīng)緩沖液(不含Mg C1₂)2.0μL；Mg C1₂溶液(25 mmol／L)1.2 μL；4×dNTP混合物(每種2.5 mmol／L)1.6 μL；Primer Hf 0.75 μL；Primer Hr 0.75 μL；DNA模板0.5 μL；無菌去離子水12.2 μL；TaqDNA聚合酶1.0 μL；總體積為20.0 μL。電泳檢測產(chǎn)物。

1．4 TCG生物學(xué)特性比較

主要進行PDA培養(yǎng)基上LCG5與TCG形態(tài)對比：將分離培養(yǎng)的TCG，用打孔器打成大小相同的菌塊接到PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，菌絲長滿培養(yǎng)皿后觀察記錄。

2結(jié)果與分析

2．1 CG遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

2．1．1CG產(chǎn)孢能力及致病力的測定結(jié)果

自海口、湛江、儋州3處采集地的CG菌株產(chǎn)生分生孢子能力和對芒果果實致病力的測定結(jié)果如表1所示：湛江2號和儋州2號菌株產(chǎn)生分生孢子能力最強，但其對芒果果實的致病力均居于中、下水平?？紤]到本研究試圖要建立的突變體庫最終是為了進行cG的致病機制分析，本研究選用致病力最強、產(chǎn)孢能力中等的儋州第5號菌株，既保證了轉(zhuǎn)化

體系的成功建立，又方便對突變體庫的致病和產(chǎn)孢相關(guān)突變體的篩選。為了敘述方便，將此菌株用代號LCG5代表。

2．1．2抑制LCG5的潮霉素的最佳濃度篩選結(jié)果

LCG5在含不同濃度潮霉素的MM培養(yǎng)基上的菌落生長情況歸納于表2。表2的結(jié)果表明，LCG5接種到MM培養(yǎng)基上，在24 h之內(nèi)，生長情況看不出明顯的差異；在40 h后觀察，能看到對照孢子萌發(fā)并形成1～2 cm大小的菌落，120、140 μg／mL濃度開始有擴展，其他的濃度下并沒有明顯變化；在48 h后再觀察，120、140 μg／mL處理下菌落孢子有明顯萌發(fā)，可看出菌落擴展，160 μg／mL濃度下的炭疽菌菌落開始擴展；在72 h后再觀察，可以看出，對照已經(jīng)連接成片，100、120、140、160、180 μg／mL5個潮霉素濃度梯度下的炭疽菌都有不同程度的擴展，200 μg／mL稍有擴展，但不是很明顯，220 μg／mL的潮霉素濃度F，基本上沒什么變化。因此，結(jié)果認為潮霉素濃度200μg／mL為最佳的篩選濃度。

2．1．3共培養(yǎng)方法的篩選結(jié)果

2．1．3．1不同農(nóng)桿菌和共培養(yǎng)基的酸堿度對轉(zhuǎn)化效率影響的測定結(jié)果

表3是使用不同酸堿度的IM培養(yǎng)基上農(nóng)桿菌AGL-1的轉(zhuǎn)化效率數(shù)據(jù)。培養(yǎng)基的酸堿度對轉(zhuǎn)化效率有顯著的影響，進行SAS分析，發(fā)現(xiàn)pH5.5時轉(zhuǎn)化最好。

2．1．3．2農(nóng)桿菌AGL-1菌液不同濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響測定結(jié)果

表4為使用農(nóng)桿菌AGL-1不同濃度的菌液得到的轉(zhuǎn)化效率數(shù)據(jù)。OD₆₆₀= 0.75菌液梯度稀釋作轉(zhuǎn)化試驗，使用稀釋5×的菌液得到的轉(zhuǎn)化效率最高，與其他濃度之間的差異達到極顯著。稀釋10、15×的其次，1、20×最低。

2．1．3．3AS對轉(zhuǎn)化效率的影響

用IM作共培培養(yǎng)基(pH5.5)，MM作篩選培養(yǎng)基，AS濃度設(shè)定為：200和0 μmol／L，在相同的試驗條件下進行遺傳轉(zhuǎn)化試驗，潮霉素的篩選濃度為200 μg／mL，結(jié)果顯示沒有加AS的處理基本上沒有抗潮霉素的菌落出現(xiàn)，而含有AS的處理轉(zhuǎn)化效率平均達到38個抗潮霉素菌落／皿。

2．2對LCG5的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體的鑒定結(jié)果

2．2．1TCG對潮霉素抗性的穩(wěn)定性檢測

含潮霉素200 μg／mL的PDA上，接種48 h后CG與TCG的菌落生長情況：TCG在篩選培養(yǎng)基上擴展2 cm左右，LCG5被潮霉素抑制。潮霉素濃度保持不變繼續(xù)在PDA篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)共5代。結(jié)果顯示：TCG對潮霉素的抗性穩(wěn)定遺傳。

2．2．2PCR檢測

隨機選取的LCG5及13個TCG，提取DNA與從農(nóng)桿菌AGL-1及EHAl05提取的質(zhì)粒DNA進行PCR擴增，結(jié)果顯示13個抗性菌株擴增出與陽性帶大小一致的約800 bp的條帶，證明潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因已整合到LCG5轉(zhuǎn)化子的基因組中(圖1)。

2．3 LCG5的大規(guī)模轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體的生物學(xué)特性

2．3．1LCG5優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化體系

綜合上述LCG5的遺傳轉(zhuǎn)化各個參數(shù)研究結(jié)果，總結(jié)出LCG5的遺傳轉(zhuǎn)化操作程序如下：

1)無菌牙簽挑取農(nóng)桿菌AGL-1單菌落，接種于Ⅵ1P液體培養(yǎng)基(卡那霉素：50μg／mL；利福平：25 μg／mL)，200 r／min振蕩培養(yǎng)，28℃過夜培養(yǎng)至對數(shù)期。在加有YEP固體平板培養(yǎng)基(卡那霉素：50 μg／mL；利福平：25 μg／mL)上畫線，28℃培養(yǎng)2～3 d。

2)無菌牙簽挑取農(nóng)桿菌AGL-1單菌落，接種于MMRK液體培養(yǎng)基，28℃、200 r／min振蕩過夜培養(yǎng)，稀釋測定OD₆₆₀＝0.15。

3)取OD₆₆₀=0.15的LCG5菌液5 mL，4 000 r／min離心5 min，倒去上清，5 mL pH5.5 IM液體培養(yǎng)基重懸，每管加入200 μmol／mL的AS(乙酰丁香酮)0.5 μL，28℃下，200 r／min搖6 h。

4)搖6 h后的農(nóng)桿菌溶液，與濃度為3×10⁵個孢子／mL的CG菌液等體積混合，搖勻。

5)硝酸纖維濾膜緊貼在IM固體培養(yǎng)基上，每皿取400 μL混合液均勻涂抹到硝酸纖維濾膜上，于無菌操作臺上晾干，封口，在28℃恒溫下培養(yǎng)48 h。

6)無菌牙簽挑取已萌發(fā)的孢子，點接在MM固體培養(yǎng)基(潮霉素：200 μg／mL；鏈霉素：100 μg／mL；頭孢霉素：100 μg／mL)上。一個皿中不同位置大約點接100個點。

7)在光照條件下28℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑生長良好的菌落轉(zhuǎn)接在PDA固體培養(yǎng)基(潮霉素：200 μg／mL；鏈霉素：100 μg／mL；頭孢霉素：100 μg／mL)上作進一步篩選。

8)對抗性菌株單孢分離，在PDA固體培養(yǎng)基(潮霉素：200 μg／mL)上繼代篩選，并作保存。

按照優(yōu)化后的操作程序，對LCG5進行大規(guī)模遺傳轉(zhuǎn)化，平均轉(zhuǎn)化效率達到38個轉(zhuǎn)化體／皿，相當(dāng)于每1×10⁵個LCG5分生孢子得到38個轉(zhuǎn)化體。從所得的突變體中，隨機選出100個經(jīng)單孢分離并繼代篩選表明抗性穩(wěn)定，又經(jīng)PCR檢測，證實這些轉(zhuǎn)化體確實在基因組中已經(jīng)插入了抗潮霉素基因。

2．3．2TCG的生物學(xué)特性觀察

從上述遺傳轉(zhuǎn)化體中挑選出11個PCR檢測均為陽性，但在表型上與LCG5有明顯差異的轉(zhuǎn)化體，進行培養(yǎng)和觀察、記錄各種表型特征(表5)。

菌絲顏色改變：LCG5是白色菌絲，部分突變體菌絲顏色改變?yōu)榛疑?，如TCG3、TCG7、TCG8、TCG9；產(chǎn)孢能力改變：有些突變體產(chǎn)孢量明顯降低，如TCG5、TCG6、TCG7、YCG8、TCG9、TCG10、TCG11；菌落形態(tài)改變：部分菌落出現(xiàn)扇變，如TCG5、TCG6、突變型11。

3討論

3．1關(guān)于CG的遺傳轉(zhuǎn)化體系

本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化膠孢炭疽菌的條件探索和對比，獲得CG遺傳轉(zhuǎn)化的AS濃度、農(nóng)桿菌濃度、CG分生孢子濃度、共培養(yǎng)的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基和農(nóng)桿菌等最佳的參數(shù)，最后組建成高效的CG遺傳轉(zhuǎn)化體系。經(jīng)實際應(yīng)用證實，用該體系進行芒果炭疽病菌菌株LCG5的遺傳轉(zhuǎn)化效率較高，操作也比較方便。該轉(zhuǎn)化體系的建立，為CG功能基因組學(xué)，尤其是致病性的功能基因組學(xué)研究奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)。關(guān)于炭疽菌有關(guān)種的遺傳轉(zhuǎn)化，國外已經(jīng)有些報道。如Groot等已經(jīng)成功地利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Colletotrichum hloeosporioides，Epetein等利用限制酶介導(dǎo)整合(REMI)插入誘變技術(shù)，實現(xiàn)對C.gra-minicola的遺傳轉(zhuǎn)化。但迄今為止，國內(nèi)還沒有關(guān)

于芒果炭疽菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究報道。

根據(jù)以往的經(jīng)驗，在進行真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中，目的真菌的野生菌株的選擇直接影響轉(zhuǎn)化效率。而且，同一種真菌的不同菌株，對作為篩選的潮霉素的敏感性可能存在很大差異。本研究基于篩選致病相關(guān)突變體的考慮，在CG野生菌株的選擇上，綜合考慮致病力、產(chǎn)孢能力和對潮霉素敏感程度，通過對比篩選，從來自我國芒果種植區(qū)的14個菌株中選出分生孢子產(chǎn)生能力中等、致病力強、對潮霉素敏感的LCG5菌株作為轉(zhuǎn)化的野生菌株。既保證了轉(zhuǎn)化體系的成功建立，又方便對突變體庫的致病和產(chǎn)孢相關(guān)突變體的篩選。

本研究結(jié)果表明，潮霉素在MM培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上雖然可以抑制LCG5的生長，可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，但是CG在平板培養(yǎng)基上對潮霉素有較高的耐受性，抑制濃度比較高，必須達到200 μg／mL才能達到較好的抑菌效果。因此利用價格昂貴的潮霉素進行CG的遺傳轉(zhuǎn)化篩選突變體，其成本比較高。這個問題在絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中普遍存在。但是，就CG而言，應(yīng)該有一些解決的辦法，比如，可以通過大規(guī)模的CG菌株篩選，從中尋找對潮霉素更加敏感的菌株，用于遺傳轉(zhuǎn)化。又如，據(jù)有關(guān)文獻報道，BAR(一種價格便宜的除草劑)已經(jīng)被成功地作為選擇標(biāo)記用于稻瘟菌遺傳轉(zhuǎn)化上，苯菌靈(一種價格低廉的殺菌劑)也被成功地作為選擇標(biāo)記用于遺傳轉(zhuǎn)化上。可否將其移用于CG的遺傳轉(zhuǎn)化，值得進一步探索。

農(nóng)桿菌菌液濃度的差異也是影響轉(zhuǎn)化效率的一個很重要的因素。表面上看，菌液濃度越大，轉(zhuǎn)化的機會應(yīng)該越大，所以轉(zhuǎn)化率應(yīng)該高些，但事實并非如此。其原因可能是因為菌液濃度過大造成共培養(yǎng)后殺除農(nóng)桿菌比較困難、農(nóng)桿菌與CG搶占營養(yǎng)而造成CG形成菌落受到阻礙的緣故。

在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基酸堿度篩選中，作者發(fā)現(xiàn)，微酸條件下(pH5.5)CG的轉(zhuǎn)化效率最高，即抗性菌率最高。其原因可能是微酸性條件有利于激活農(nóng)桿菌的侵染毒性、促進CG菌絲生長。

通過對比試驗，發(fā)現(xiàn)添加200 μmol／L的乙酰丁香酮，確實可以大大提高CG的轉(zhuǎn)化效率，而且用乙酰丁香酮對農(nóng)桿菌進行預(yù)處理，遺傳轉(zhuǎn)化效率更高。

3．2關(guān)于LCG5的突變體

利用上述轉(zhuǎn)化體系進行大規(guī)模的LCG5轉(zhuǎn)化操作。在所得的突變體中，隨機選出100個進行系統(tǒng)分析，獲得了TCGll個菌落形態(tài)改變的突變體，其中6個為產(chǎn)孢量減少突變體，3個為菌落形態(tài)的突變體。這些突變體的獲得，為研究膠孢炭疽菌形態(tài)發(fā)育、致病關(guān)鍵階段的相關(guān)基因克隆和分子調(diào)控機制研究奠定了基礎(chǔ)，最終為揭示膠孢炭疽菌與芒果相互作用的分子機制，為最終培育持久抗病品種和制定膠孢炭疽菌引起的病害的持久治理措施和策略奠定了基礎(chǔ)。

3．3有待進一步研究的問題

由于時間關(guān)系，本研究還沒來得及對獲得的遺傳轉(zhuǎn)化體進行southern檢測，不知道插入拷貝數(shù)，有待補充。另外，本研究獲得的突變體比較少，為了使插入突變覆蓋CG的整個基因組的每個基因，必須大規(guī)模篩選CG突變體。再者，本研究雖然優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)膠孢炭疽菌的轉(zhuǎn)化條件，但總的轉(zhuǎn)化效率還不夠理想，如何進一步提高轉(zhuǎn)化效率成為一個迫切需要解決的問題。