摘要：目的 研究三七總皂苷(PNS)對局部腦缺血再灌注后腦組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響，探討PNS對缺血再灌注后神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法 參照ZeaLonga線栓法制作大鼠大腦中動脈阻塞模型(MCAO)，100只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、缺血再灌組和PNS治療組。每組大鼠再隨機(jī)分成4組，分別在再灌注后6h，24h，48h，96h處死。用免疫組化法檢測缺血腦組織冷凍切片TNF-α的陽性表達(dá)。結(jié)果 假手術(shù)組腦內(nèi)有極少量表達(dá)；缺血再灌組與PNS治療組各時間點(diǎn)表達(dá)明顯強(qiáng)于假手術(shù)組(P<0.01)，PNS治療組各時間點(diǎn)表達(dá)弱于缺血再灌組，陽性細(xì)胞數(shù)亦明顯減少(P<0.01)。結(jié)論 三七總皂苷對腦缺血再灌注后TNF-α的表達(dá)有降低趨勢。

關(guān)鍵詞：腦缺血；缺血再灌注；腫瘤壞死因子；三七總皂苷

中圖分類號：R743.31 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)07-0597-03

在腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一——過度的炎癥反應(yīng)中，腫瘤壞死因子(TNF-α)是主要的致炎因子。本實驗通過建立大鼠大腦中動脈阻塞模型(MCAO)腦缺血再灌注模型，觀察腦缺血后TNF-α的陽性表達(dá)以及三七總皂苷(sapomons ofpanax notogmseng，PNS)對其的影響，進(jìn)一步了解PNS在腦缺血后炎性反應(yīng)中的作用及意義。

1 材料與方法

1．1 材料 100只成年健康SD大鼠，體重260g～300g，由上海實驗動物中心提供。TNF-α免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，三七總皂苷由黑龍江珍寶島制藥有限公司提供。

1．2 動物分組 100只成年健康SD大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(20只)，缺血再灌組(40只)，PNS治療組(40只)。缺血再灌組、PNS治療組大鼠均采用左側(cè)大腦中動脈線栓法建立局部短暫腦缺血模型，缺血1h后拔出線栓頸外動脈段即為再灌注開始時間；假手術(shù)組手術(shù)操作除不插入線栓外其他同缺血再灌組，PNS治療組大鼠在線栓堵塞大腦中動脈的同時腹腔內(nèi)注射PNS(50mg/kg)。分別于術(shù)后6h，24h，48h，96h處死大鼠，斷頭取腦。取額極后部分腦組織行紅四氮唑(TTC)染色，出現(xiàn)白色梗死區(qū)者，為MCAO模型成功。

1．3 標(biāo)本制作及檢測 取腦組織后每個取材點(diǎn)的后腦部分冷凍切片進(jìn)行。TNF-α的免疫組化檢測采用SABC染色，觀測腦組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)，免疫組化顯色顯微鏡下觀察著色呈棕褐色為陽性。

1．4 結(jié)果判定 腦缺血后皮層及紋狀體區(qū)對缺血最敏感，損傷較明顯，故著重觀察皮層及紋狀體區(qū)細(xì)胞變化。觀察切片中陽性細(xì)胞數(shù)目及染色深淺程度。陽性結(jié)果定量，采用微量計數(shù)法(10目鏡X40目鏡)，以顯色陽性的細(xì)胞數(shù)/高倍視野表示，并用顯微鏡定量圖像分析儀進(jìn)行分析。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0軟件處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，建立數(shù)據(jù)庫，采用方差分析及兩兩比較t檢驗。

2 結(jié)果

假手術(shù)組在大腦皮質(zhì)和紋狀體等部位可觀察到TNF-α的弱陽性表達(dá)，說明正常情況下，腦內(nèi)有少量的TNF-α表達(dá)，主要集中在神經(jīng)元和微血管內(nèi)皮細(xì)胞。缺血再灌組各時相點(diǎn)的TNF-α的表達(dá)較假手術(shù)組皆明顯增強(qiáng)(P<0.01)，自再灌注6h組開始在大腦皮質(zhì)和紋狀體區(qū)等區(qū)域出現(xiàn)了TNF-α的強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)增加，染色變強(qiáng)。再灌注24h組TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)目及染色強(qiáng)度較6h組明顯增強(qiáng)(P<0.01)，至再灌注48h組最強(qiáng)，較再灌注24h組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，再灌注96h組表達(dá)仍較強(qiáng)，與48h組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PNS治療組TNF-α陽性細(xì)胞的分布與缺血再灌組基本一致。PNS治療組在各時點(diǎn)的TNF-α表達(dá)較假手術(shù)組皆明顯增強(qiáng)(P<0.01)，且表達(dá)強(qiáng)度隨時間的變化規(guī)律與缺血再灌組相同，但是PNS治療組再灌注各時點(diǎn)的TNF-α的陽性表達(dá)皆明顯弱于缺血再灌組(P<0.01)。

3 討論

近年來，TNF-α在腦缺血再灌注損傷過程中的作用越來越引起人們的關(guān)注。TNF-α是一種缺血性腦損傷關(guān)鍵性介質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)組織內(nèi)不僅星形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)可產(chǎn)生TNF—d，神經(jīng)元亦可產(chǎn)生TNF-α。TNF-α在腦缺血損傷中的作用也是雙重的，少量的TNF-α具有中樞保護(hù)作用，TNF-α誘導(dǎo)線粒體合成錳超氧歧化酶(Mn-SOD)等神經(jīng)保護(hù)蛋白，也能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)表達(dá)生長因子。TNF-α可通過抗氧化途徑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，增強(qiáng)神經(jīng)元在再灌注過程中抵抗氧自由基的損害。說明TNF-α在腦組織損傷恢復(fù)及神經(jīng)保護(hù)方面具有重要意義。但過量TNF-α可通過不同的機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷。在本研究中采用免疫組織化學(xué)的方法觀察了腦缺血再灌注時TNF-α表達(dá)。結(jié)果顯示在假手術(shù)組皮層海馬區(qū)等部位可有少量TNF-α的表達(dá)，表明正常情況下腦內(nèi)即有少量TNF-α的表達(dá)，自腦缺血再灌注6hTNF-α表達(dá)增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)增加與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示TNF-α異常表達(dá)參與了腦缺血再灌注損傷。隨再灌注時間的延長，TNF-α的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至再灌注48h表達(dá)最明顯。

TNF-α本身對神經(jīng)元并無直接毒性作用，而是通過非神經(jīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)起作用。TNF-α的許多生物活性是通過細(xì)胞膜上受體介導(dǎo)的。腦缺血后不僅在神經(jīng)元、巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞上表達(dá)TNT-α，而且可上調(diào)TNF-α受體的表達(dá)，可在多種細(xì)胞及在血管周圍空間表達(dá)TNF-α受體，說明TNF-α參與了腦缺血后再灌注損傷。在腦缺血的病理情況下，TNF-α可通過多種不同的作用機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷：①促炎性作用。與中性粒細(xì)胞有關(guān)的炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷中起關(guān)鍵作用。TNF-α可上調(diào)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM－1)和選擇素等的表達(dá)，激活巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1(IL-1)口]，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8(IL-8)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)產(chǎn)生，還可激活腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性代謝產(chǎn)物如血小板活化因子(PAF)、集落刺激因子等炎性介質(zhì)，激活白細(xì)胞，加重了炎癥。②抑制核因子Kappaβ(NF-κB)的活性。增加腦細(xì)胞對TNF-α細(xì)胞毒性的敏感性。③損傷血腦屏障(BBB)。TNF-α在腦局部缺血時能增加血腦屏障通透性。④促凝作用。TNF-α可抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血栓調(diào)節(jié)素，改變細(xì)胞表面的血凝和抗凝血機(jī)制，降低蛋白C抗凝作用，導(dǎo)致血管內(nèi)凝血。誘導(dǎo)血小板活化因子、組織因子、Ⅷ因子的釋放，從而促發(fā)一些凝血因子活化。⑤誘導(dǎo)一氧化氮(NO)產(chǎn)生。TNF-α可作用于多種炎性細(xì)胞誘導(dǎo)一氧化氮合酶(NOS)激活，使NO合成增加，從而加重對組織的損傷。Betz等的研究也支持這一觀點(diǎn)，另外Zhaimi等研究證實TNF-α可直接或者通過誘導(dǎo)神經(jīng)毒性介質(zhì)如NO的產(chǎn)生導(dǎo)致梗死病灶的進(jìn)展。⑥誘導(dǎo)凋亡的作用。通過和細(xì)胞膜上的TNFR結(jié)合，觸發(fā)信號傳導(dǎo)級聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

欣腦肽的主要成分是三七總皂苷，近年來的不少研究文獻(xiàn)證明，三七總皂苷能降低心肌耗氧量，改善心肌缺血，提高氧飽和度，阻止再灌流期局部腦血流量的降低，抑制再灌注蛋白激酶C的激活及鈣超載，減少自由基和興奮性氨基酸的釋放。馬麗焱等發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可明顯減少缺氧／再給氧損傷時細(xì)胞內(nèi)酶的釋放減輕細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，提高了細(xì)胞存活率。本研究結(jié)果顯示，PINS對腦缺血再灌注后腦內(nèi)TNF-α的表達(dá)有極為顯著的影響，與同一時期缺血后再灌注組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明了PNS可顯著抑制腦缺血再灌注后不同時期內(nèi)TNF-α的表達(dá)，降低了TNF-α的水平，從而減輕了缺血后由TNF-α介導(dǎo)的一系列損傷，減少神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，為臨床治療提供了新的理論依據(jù)。

(本文編輯 王雅潔)